鉄源としてヒトヘモグロビンを用いた黄色ブドウ球菌の成長
Summary
ここでは、のための増殖アッセイを記述<em>黄色ブドウ球菌</em>利用可能な栄養素鉄の唯一の供給源としてヘモグロビンを用いた。このアッセイは、ヘモグロビン由来の鉄獲得に関わる細菌因子の役割を確立します。
Abstract
黄色ブドウ球菌は、鉄が重要な代謝機能と原因疾患を遂行する必要があり、病原性細菌である。人間のホスト内の鉄の最も豊富な貯水池はヘモグロビンのヘム補因子である。ヘモグロビンから鉄を獲得するには、S.黄色ブドウ球菌は、鉄調節表面決定因子（ISD）システム1として知られている精巧なシステムを採用しています。 ISDシステム最初のバインド、ホスト·ヘモグロビンの構成要素は、次に抽出し、ヘムをインポートして、最終的に細菌の細胞質2,3にヘムから鉄を遊離する。この経路は、in vitro試験4-9 の数多く通って解剖されています。さらに、感染症へのISDシステムの寄与を繰り返しマウスモデル8,10-14で実証されている。ヘモグロビン由来の鉄獲得にISDシステムの寄与を確立し、成長がより困難であることが証明された。唯一の鉄源としてヘモグロビンを用いた増殖アッセイは、b複雑なものyの市販のヘモグロビンの不安定、フリー増殖培地中の鉄、鉄キレート剤に関連する毒性を汚染。ここでは、これらの制限を克服する方法を提案する。高品質のヘモグロビンは、新鮮な血液から調製されており、液体窒素中で保存されています。精製されたヘモグロビンは脊椎動物宿主病原体内部で発生した鉄 – 劣悪な環境を模倣した鉄枯渇培地に補充される。 Sを飢えによって遊離鉄の黄色ブドウ球菌 、我々は、ヘモグロビンを結合するヘムを抽出し、細菌の細胞エンベロープを通ってヘムを通過して細胞質内でヘムを分解する能力に完全に依存した方法で成長を誘発するヘモグロビンの低侵襲操作形で補う。このアッセイは、Sのhemoglobin-/heme-derived鉄獲得のメカニズムを解明しようとしている研究者にとって有用であろうブドウ球菌およびおそらく他の細菌性病原体。
Protocol
1。新鮮な血液からヘモグロビンの精製抗凝固剤を補充した新鮮なヒト血液を取得します。浄化を通して氷上もしくは4℃で血液℃で保管してください。 1500×gで20分間血液を遠心分離します。赤血球は（赤血球）チューブの底になります。注意深く上清を吸引し、ゆっくりと氷冷0.9％（w / v）のNaCl溶液中でペレットを再懸濁します。遠心分離を繰り返し、3回洗浄します。 <li…
Representative Results
我々は、HPLC（プロトコルステップ1.7）で溶血からヒトヘモグロビンを精製した。 図1は、280および410 nmの波長での溶出液の吸光度を記録した。フラクション5を回収し、他の画分を廃棄した。溶出液のミリリットル当たりのヘモグロビンの五から十五ミリグラムの収量は、一般的に取得される。精製されたヘモグロビンは、重複でSDS-PAGEで分析したところ、ゲルをどちらかのタン?…
Discussion
鉄は人生15のすべての国からの生物が必要とする必須栄養素である。脊椎動物では、鉄は、この要素によって引き起こされる毒性を避けるために隔離されている。この隔離はまた、栄養免疫16として知られている過程で微生物が侵入してくるから鉄を隠蔽する。応答では、病原体が栄養免疫を回避する戦略を進化させてきた。そのようなメカニズムの1つは、ホスト17内…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立アレルギー感染症研究所から米国公衆衛生局助成金AI69233およびAI073843によってサポートされていました。 EPSは、感染症の発症機序におけるバローズウェルカム·フェローでもある。 KPHは5 T32 A107611-10細胞·分子微生物学研修助成プログラムによって賄われていた。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin’s reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
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Cite This Article
Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).