Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Золотистый стафилококк рост использования человеческого гемоглобина в качестве источника железа

Published: February 7, 2013 doi: 10.3791/50072
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical School

Summary

Здесь мы опишем тест для роста

Abstract

Золотистого стафилококка является патогенная бактерия, которая требует железо для выполнения жизненно важных функций обмена веществ и вызывают болезнь. Наиболее распространенными водохранилища железа внутрь человеческого организма является гема, который является кофактором гемоглобина. Для получения железа из гемоглобина, С. золотистого использует сложные системы, известной как железо-регулируемых поверхности определителя (Isd) системы 1. Компоненты Isd системы в первую очередь связывают гемоглобин хоста, а затем извлечь и импортировать гема, и, наконец, освобождение железа из гема в бактериальной цитоплазме 2,3. Этот путь был расчлененный через многочисленные лабораторные исследования 4-9. Кроме того, вклад Isd системы инфекцию неоднократно продемонстрирована на мышах 8,10-14. Создание вклад Isd система гемоглобина, полученных железа приобретения и рост оказался более сложным. Рост анализов с использованием гемоглобина в качестве единственного источника железа сложно бУ нестабильность коммерчески доступных гемоглобина, загрязняя свободного железа в питательной среде, и токсичность, связанная с железом энтеросорбенты. Здесь мы представляем метод, который преодолевает эти ограничения. Высокий гемоглобин качества получается из свежей крови и хранится в жидком азоте. Очищенная гемоглобина дополняется в железо-разрушающих среднего имитируя железа плохих условиях, с которыми сталкивается патогенов внутри позвоночного хозяина. К голодающим С. золотистого свободного железа и дополнения с минимально манипулировать формой гемоглобина Мы вызвать рост в манере, которая полностью зависит от способности связывать гемоглобин, извлечь гема, проходит через гема бактериальной клетки конверт и ухудшить гема в цитоплазме. Этот анализ будет полезен для исследователей, стремящихся выяснения механизмов hemoglobin-/heme-derived приобретения железа в S. стафилококка и, возможно, других бактериальных патогенов.

Protocol

1. Очистка гемоглобина от Fresh Blood

  1. Получить свежую человеческую кровь дополнить антикоагулянта. Держите кровь на льду или при температуре 4 ° С в течение очистки.
  2. Центрифуга крови в течение 20 мин при 1500 х г. Красных кровяных клеток (эритроцитов) будет в нижней части трубы. Осторожно аспирации супернатант и осторожно ресуспендируют осадок в ледяной 0,9% (вес / объем) раствора NaCl. Повторите центрифугирования и промыть 3 раза.
  3. Ресуспендируют гранул в 1 объеме ледяного 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0). Это приведет к лизису эритроцитов вследствие осмотического давления. Добавить толуола до ~ 20% конечного объема.
  4. Инкубировать при температуре 4 ° С на вертеле в течение ночи.
  5. Центрифуга лизата при 20000 х г в течение 1 часа. Сбор средней фракции гемолизата оставив толуол (плавающая сверху) и гранул нетронутым. Используйте длинную шею-пипетка для сбора средней фракции.
  6. Пройдите через 0,44 мкм фильтр шприца. Если раствор содержит частицыматерия и не могут быть переданы через фильтр, повторите шаг 1,5.
  7. Очищают гемоглобина (Hb) с высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) анионообменную колонку (Varian, PL-SAX 1000 в 8 мкм, 150 мм х 4,6 мм). В качестве подвижной фазы составляет 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и подвижной фазы B является 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) + 0,5 М NaCl. 0% -100% градиентом растворителя B выполняется в течение 2 мин при 2,0 мл / мин, скорость потока. Элюирования контролируется на основе поглощения (λ: 410 нм и 280 нм). Собирайте только фракция характеризуется ярко-красный цвет и видный пик поглощения (рис. 1).
  8. Диализировать элюирования против фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение ночи, а затем в течение нескольких часов снова. Стерилизовать при прохождении через фильтр 0,22 мкм шприц.
  9. Для измерения концентрации гемоглобина, готовят стандартные растворы гемоглобина известных концентраций в PBS. Определить концентрацию гемоглобина в образце путем смешивания стандартного решения (см. таблицу с реагентами насред) или раствор образца с реагентом 2x Драбкин (в приготовленный из порошка) в соотношении 1:1. Например, смешать 100 мкл раствора гемоглобина с реагентом 100 мкл 2x Драбкин в 96-луночных планшетах. Инкубировать в течение 15 мин и измеряют оптическую плотность при 540 нм. Постройте стандартную кривую и определить концентрацию гемоглобина в образце. От пяти до пятнадцати мг / мл дает являются типичными.
  10. Выполнить 15-20 мкг очищенного гемоглобина на 15% SDS-PAGE в двух экземплярах. Пятно одним из гелей, передает белки от другого геля на нитроцеллюлозные мембраны и иммуноблот для гемоглобина (рис. 2).
  11. Замораживание и хранение 1 мл аликвоты гемоглобина в жидком азоте.

2. Подготовка железной разрушающих Медиа роста

  1. Подготовка Roswell Park Memorial Institute (RPMI) бульона путем растворения порошка в RPMI воды, добавьте бикарбонат натрия в соответствии с рекомендациями производителя и 1% cassamino кислоты (CA) (вес / объем). Стерилизовать при прохождении через фильтр 0,2 мкм и магазин холодильниковускоренными.
  2. Подготовка металла обедненный RPMI (NRPMI), добавив 7% (вес / объем) Chelex 100 и перемешивания в течение ночи на магнитной мешалки. Удалить Chelex 100, проходя через фильтр 0,2 мкм и хранить в холодильнике. Дополнение сред с существенным цветных металлов: 25 мкМ ZnCl 2, 25 мкМ MnCl 2, 100 мМ CaCl 2 и 1 мМ MgCl 2, заранее подготовленных в виде стерильного 1000 х решение. Использование одноразовых пластиковых контейнеров для этого шага, чтобы избежать загрязнения железом из повторно используемых материалов.

3. Золотистый стафилококк рост использования Гемоглобин в качестве единственного источника Железная

  1. Подряд S. золотистый для изоляции на триптического соевый агар (TSA) из замороженного запаса. Инкубировать при 37 ° С в течение 20-24 часов.
  2. Ресуспендируют этилендиамин-N, N'-бис (2-гидроксифенилуксусной кислоты) (EDDHA) в безводном этаноле до 100 мМ. EDDHA не переходит в раствор, но стерилизуют этанолом.
  3. Добавить EDDHA в RPMI до конечной концентрации 0,5 мМ. ПозволятьEDDHA распустить в течение по крайней мере 30 минут, прежде чем переходить к следующему шагу. Благодаря партии к партии изменения, конечная концентрация EDDHA возможно, должны быть снижены до 0,25 мм, чтобы рост бактерий.
  4. Инокулировать одной колонии S. золотистый в 5 мл RPMI содержащие EDDHA в 15 мл завинчивающейся крышкой конических труб. Инкубировать при 37 ° C при встряхивании на 180 оборотов в минуту (RPM) в течение 16-20 часов.
  5. Центрифуга ночь культур в течение 5 мин при 7500 мкг и ресуспендируют осадок в NRPMI, содержащего 0,5 мМ EDDHA. Нормализация OD 600 до ~ 3.
  6. Подготовка NRPMI, содержащего 2,5 мкг на мл Hb и 0,1-1,0 мм EDDHA. Из-за различий между партиями, концентрация EDDHA, необходимых для хелатные свободного железа в NRPMI могут отличаться.
  7. Субкультура 10 мкл бактериальной суспензии с шагом 3,5 в 1 мл NRPMI + + EDDHA Hb в 15 мл завинчивающейся крышкой коническую трубку.
  8. Инкубируют культуры при 37 ° С в течение 48 ч при встряхивании при 180 оборотах в минуту или по скользящему барабан.
    9. 600 показаний путем удаления 50 мкл культуры и смешивая его с 150 мкл PBS в 96-луночных планшетах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы очищенного человеческого гемоглобина гемолизата с помощью ВЭЖХ (протокол шагом 1,7). Рисунке 1 показан записанный поглощение элюата при 280 и 410 нм длины волны. Доля 5 была собрана и другие фракции были отброшены. Доходность от пяти до пятнадцати миллиграммов на миллилитр гемоглобина элюата, как правило, приобрели. Очищенная гемоглобин был проанализирован SDS-PAGE в двух экземплярах и гели либо окрашивают в течение белков или переносили на нитроцеллюлозные и иммуноблоттинг (протокол шагом 1,10, рисунок 2).

Мы оценили способность очищенного гемоглобина человека, чтобы поддержать рост дикого типа С. стафилококка и С. золотистого, что не хватает ИБР компонент системы Isd (Δ ИБР). ИБР гемоглобина рецепторов, необходимых для гемоглобина полученных приобретения железа 12. Дикий тип и Δ ИБР были выращены в железо-обедненного среде с добавлением человеческого hemog Лобин (NRPMI + + EDDHA Hb), как описано в разделе 3 протокола. При выращивании в NRPMI + + EDDHA Hb, дикого типа, но не Δ ИБР имеет возможность размножаться, как показано увеличение оптической плотности культуры с течением времени (рис. 3А). В противоположность этому, возможность использовать дополнен свободного железа (+ FeCl 3) идентичны в дикий тип и Δ ISDB (рис. 3В). Ни дикого типа, ни Δ ИБР размножаться в отсутствие источника железа (рис. 3В).

Мы сравнили рост S. золотистый в NRPMI + EDDHA дополнен с гемоглобином очищают от свежей крови или лиофилизированного гемоглобина. Рисунок 4 показывает, что в то время как гемоглобин очищают от крови требует ИБР для роста, лиофилизированный гемоглобина обеспечивает распространение Δ ИБР.

s/ftp_upload/50072/50072fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Поглощение элюирования фракций гемоглобина во время очистки. Поглощение при 410 нм (специфичные для гем-связывающего белка) и 280 нм (характерные для всех белков) была контролируются на протяжении элюирования. Доля номер пять, содержащихся гемоглобина и была собрана.

Рисунок 2
Рисунок 2. Очищенная гемоглобина человека Двадцать микрограммов очищенного гемоглобина был отделен использованием денатурирующих 15% SDS-PAGE. А. Гель окрашивали для белков с Bio-Rad белка реагента красителя анализа. B. нитроцеллюлозные мембранные иммуноблоттинг для гемоглобина. Интенсивное нижняя полоса является гемоглобин мономера, в то время как более слабые верхние полосы гемоглобина димеров и tertramers, которые не получили полностью денатурированной.

/ Ftp_upload/50072/50072fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Использование человеческого гемоглобина в качестве источника железа С. золотистого A. Рост дикого типа (WT) или изогенных гемоглобина рецепторов ИБР мутант (Δ ИБР) в NRPMI дополнить хелатора железа EDDHA и человеческого гемоглобина является статистически различны, как определяется двумя хвостами Стьюдента испытаний, р <0,05. B. Рост NRPMI с добавлением 10 мкМ хлорида железа (+ FeCl 3) или EDDHA (-FeCl 3) ничем не отличается от масс и Δ ИБР. Графики показывают данные из представителей эксперимент, который включал в себя три биологических повторностях. Ошибка полосы обозначают стандартное отклонение оптической плотности в указанных точках времени между повторениями.

Рисунок 4
Рисунок 4. Рост дикого типа (WT) или изогенных м рецепторов гемоглобинаutant (Δ ИБР) в среде с гемоглобином очищают от свежей крови или лиофилизированного гемоглобина. график показывает данные с представителем эксперимент, который включал в себя три биологических повторностях. Погрешностей представляют стандартное отклонение оптической плотности в указанных точках времени между повторениями. Звездочки обозначают значения, которые являются статистически различны, как определяется двумя хвостами Стьюдента испытаний, р <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Железо является важнейшим питательным требуется организмов из всех царств жизни 15. У позвоночных, железо поглощенных чтобы избежать токсичности, вызванные этим элементом. Это поглощение таит в себе железо от вторжения микробов в процессе, известном как питание иммунитет 16. В ответ на патогенные развивались стратегии, которые обойти питания иммунитета. Одним из таких механизмов зависит от гемоглобина, который является наиболее распространенным источником железа в принимающем 17. Гемоглобин содержится в красных кровяных клетках. Гемоглобин освобожден от поврежденных эритроцитов связан хозяин гаптоглобина, который сигнализирует быстрое удаление гаптоглобина-гемоглобин комплексов макрофагами 18. Для того, чтобы получить доступ к гемоглобина, С. золотистого выражает гемолизины, что лизиса эритроцитов 19. Гаптоглобин вызванной удалением гемоглобина противостоит высоким сродством гемоглобина к поверхности клеточных рецепторов выраженные 20.

Многочисленные исследования показали, вклад Isd системы к инфекции 8,10-14. Кроме того, биохимические исследования возложены функции ее отдельных компонентов гемоглобина, железа, полученных приобретение 4-9. Здесь мы опишем анализа, который контролирует рост S. золотистый с гемоглобином в качестве единственного источника доступного железа. В этой связи мы должны отметить определенные условия, которые являются ключевыми для успеха эксперимента.

Качество и тип реагентов, используемых в гемоглобин полученного железа анализы приобретение рост может существенно повлиять на результаты obtaiопределены в этих анализах. В отличие от гемоглобина, полученных из свежей крови, гемоглобин, который хранится в лиофилизированной форме позволяет рост бактерий зависит от компонентов Isd системы (рис. 4) 21. Это, вероятно, связано с изменениями в структуре гемоглобина, которые вызваны лиофилизации. В частности, лиофилизированный гемоглобина содержится тетрамеры, димеров и мономеров гемоглобина, а также гема в свободной форме 22. Очистка гемоглобина от свежей крови и ее сохранения в жидком азоте обеспечения целостности белка 22. Обширное исследование на гемоглобин способствовало разработке протоколов для очистки высокого качества гемоглобина из свежей крови или в рекомбинантной форме, которая может быть использована в нашем тесте 23-25.

Выбор хелатор железа может влиять на рост анализа. Например, 2,2-дипиридила, которая часто используется в качестве комплексона железа, является токсичнымбактериальных клеток 26. Эти два эффекта сделать это трудно разглядеть, если ингибирования роста бактерий на 2,2-дипиридила связано с комплексообразования железа или токсичности. Кроме того, 2,2-дипиридила, вероятно, будет проницаемые мембраны, и таким образом проникает в бактериальную клетку и хелаты железа внутриклеточно 27. Мы обнаружили, что ингибирование роста по EDDHA восстанавливается с дополнением источник железа, что делает EDDHA более подходящим железом хелатор для бактериального анализа роста. Тем не менее, концентрация EDDHA, которая должна быть добавлена ​​к росту средней могут отличаться. Это связано с изменением как EDDHA потенции и роста среднего содержания железа от партии к партии. Деятельность железа хелатирующие могут быть нормализованы между партиями EDDHA химически удаления остаточного железа 28. Однако из-за различий между партиями RPMI, мы обнаружили, что конечная концентрация EDDHA могут по-прежнему должны быть скорректированы, чтобы рост в присутствии источника железа. Мы нашли йна самых высоких концентраций EDDHA, что является разрешительным для роста дикого типа С. золотистый в присутствии гемоглобина является оптимальной для данного эксперимента.

Изменения могут быть внесены в текущий протокол больше напоминают окружающей среды, с которыми сталкивается бактерии во время инфекции. Например, в рамках хозяина, гема, который высвобождается из гемоглобина быстро связаны hemopexin. Hemopexin не могут быть использованы в качестве источника железа С. стафилококк, поэтому его дополнение будет препятствовать приобретению гема освобожден от гемоглобина во время инкубации с С. золотистый 12.

Мы считаем, что этот анализ может быть использован для исследований в металле приобретение различных бактериальных патогенов. Кроме того, этот метод может быть использован для измерения железа приобретения из не-гемоглобин источниками железа, которые присутствуют в организме.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано США Public Health Service гранты AI69233 и AI073843 из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний. EPS является членом Burroughs Wellcome в патогенезе инфекционных заболеваний. KPH был профинансирован клеточной и молекулярной микробиологии Обучение гранта Программы 5 T32 A107611-10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin's reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

Tags

Инфекция выпуск 72 иммунологии микробиологии инфекционных заболеваний клеточной биологии патологии микроэлементы бактериальных инфекций грамположительных бактериальных инфекций бактериологии, Железа приобретение гемоглобина рост бактерий бактерии
<em>Золотистый стафилококк</em> рост использования человеческого гемоглобина в качестве источника железа
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar,… More

Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter