Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming
Summary
We beschrijven een live-cell imaging methode die inzicht geeft in eiwitdynamica tijdens de T-cel activatie proces. We tonen de totale gebruiksduur van de T-cel verspreiding assay, confocale microscopie en beeldanalyse te geven kwantitatieve resultaten volgen signalering complexvorming in T-cel activatie.
Abstract
Bescherming tegen besmettelijke ziekten gemedieerd door het immuunsysteem 1,2. T-lymfocyten zijn het meestercoördinatoren van het immuunsysteem, het reguleren van de activatie en reacties van meerdere immuuncellen 3,4. T-celactivering is afhankelijk van de herkenning van antigenen weergegeven door antigen presenterende cellen (APCs). De T-cel antigeen receptor (TCR) is voor elke T-cel kloon en bepaalt antigeenspecificiteit 5. De binding van de TCR aan het antigeen induceert fosforylatie van componenten van het TCR complex. Om T-cel activatie te bevorderen, moet dit signaal worden getransduceerd door het membraan naar het cytoplasma en de nucleus, inleiding diverse belangrijke reacties zoals recrutering signaaleiwitten de TCR, APC site (de immune synaps), hun moleculaire activatie, cytoskelet omlegging, verhoging van de intracellulaire calciumconcentratie en veranderingen in genexpressie 6,7. De juistitiation en beëindiging van activerende signalen cruciaal passende T-celreacties. De activiteit van signaaleiwitten is afhankelijk van de vorming en ontbinding van eiwit-eiwit interacties posttranslationele modificaties zoals proteïne fosforylatie, vorming van eiwitcomplexen, eiwit ubiquitinering en de rekrutering van diverse cellulaire eiwitten plaatsen 8. Inzicht in de werking van de T-cel activatie proces is voor zowel immunologisch onderzoek en klinische toepassingen.
Verschillende assays werden ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties te onderzoeken, maar niet biochemische assays, zoals de gebruikte co-immunoprecipitatie werkwijze niet toe eiwit locatie te onderscheiden, waardoor elke waarneming waardevolle inzichten in de dynamiek van cellulaire mechanismen. Bovendien, deze massa assays combineert gewoonlijk eiwitten uit verschillende cellen die mogelijk in verschillende stadia van de tHij onderzocht cellulaire proces. Dit kan een nadelig effect op temporele resolutie hebben. Het gebruik van real-time beeldvorming van levende cellen kunnen zowel de ruimtelijke volgen van eiwitten en het vermogen om tijdelijk onderscheiden signalerende gebeurtenissen, dus licht werpen op de dynamiek van het proces 9,10. We stellen een werkwijze real-time imaging van signaal-complexvorming in T-cel activatie. Primaire T-cellen of T-cellijnen, zoals Jurkat, getransfecteerd met plasmiden die coderen voor eiwitten van belang gefuseerd aan monomere fluorescerende eiwitten, dat niet-fysiologische oligomerisatie 11. Levende T-cellen worden neergezet op een dekglaasje vooraf bekleed met T-cel activerende antilichaam 8,9, dat bindt aan het CD3/TCR complex, induceren T-celactivering terwijl overwinnen dat specifieke activerende antigenen. Geactiveerde cellen voortdurend afgebeeld met het gebruik van confocale microscopie. Beeldgegevens worden geanalyseerd om kwantitatieve resultaten, zoals col opbrengstocalization coëfficiënt van de signalering eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De regulatie en werking van verschillende cellulaire processen zijn afhankelijk van de vorming en de beëindiging van eiwit-eiwit interacties. Microscopische beeldvorming maakt de real-time tracking van fluorescent gelabelde eiwitten in levende cellen. Colocalization van gemerkte eiwitten suggereren een directe of indirecte interactie tussen de eiwitten en kunnen worden gebruikt om de verkregen resultaten van biochemische werkwijzen, zoals immunoprecipitatie versterken. In tegenstelling tot de biochemische methoden, lee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Sophia Fried voor technische ondersteuning. MBS bedankt de volgende organisaties voor hun onderzoek support: The Israel Science Foundation voor subsidies no.1659/08, 971/08, 1503-1508 en 491/10, de ministeries van Volksgezondheid en Wetenschap voor subsidies niet. 3-4114 en 3-6540, het Israël Cancer Association door de Estate van wijlen Alexander Smidoda, en de Taubenblatt Family Foundation voor de Bio-medische excellentie subsidie.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. . Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
