T细胞实时成像实时信号复合物的形成
Summary
我们描述一个活细胞成像的方法在T细胞活化过程中，提供了洞察蛋白质动力学。我们展示了结合使用的T细胞扩散法，激光共聚焦显微镜成像分析得到的定量结果，按照整个T细胞活化信号复合物的形成。
Abstract
防止传染病介导的免疫系统1,2。 T淋巴细胞的免疫系统的主协调，调节多个免疫细胞3,4的活化和反应。 T细胞活化是依赖于特定的抗原的识别由抗原呈递细胞（APC）显示。具体到每个T细胞克隆的T细胞抗原受体（TCR）和确定抗原特异性5。对抗原的T细胞受体的结合诱导的磷酸化的T细胞受体复合物的组成部分。为了促进T细胞活化，该信号必须转膜细胞质和细胞核，发起各种关键的反应，如招募到TCR信号蛋白APC网站（免疫突触），其分子活化，细胞骨架重排，细胞内钙离子浓度升高，并在6,7基因表达的变化。正确itiation和终止激活信号是至关重要的适当的T细胞应答。信号蛋白的活性依赖的形成和终止的蛋白质-蛋白质相互作用，翻译后的修改，如蛋白质磷酸化，形成的蛋白质复合物，蛋白泛素化和招聘的蛋白质，各种蜂窝基站的8。了解T细胞活化过程的内部运作是至关重要的免疫学研究和临床应用。
已经开发了各种测定为了研究蛋白质 – 蛋白质相互作用，然而，生化分析，如广泛使用的免疫共沉淀法，不使蛋白的定位待观察，从而排除了宝贵的见解的观察到的动态蜂窝机制。此外，这些批量的检测通常结合蛋白吨的不同阶段，从许多不同的细胞，可能会对他研究细胞过程。这可以有一个不利的影响时间分辨率。活细胞实时成像的使用允许空间跟踪的蛋白质和信号事件之间的时间分辨能力，从而脱落的过程9,10的动态光。我们提出一个方法的实时成像的T细胞活化过程中的信号复合物的形成。的主要的T细胞或T细胞系，如Jurkat细胞，被转染的质粒编码的单体荧光蛋白融合蛋白质的利益，防止非生理齐聚11。现场T细胞下跌超过盖玻片预先涂有T细胞活化抗体8,9，结合复杂的CD3/TCR的同时克服了需要为特定的活化抗原，诱导T细胞活化。活化细胞都在不断使用共焦显微镜成像。成像数据进行分析，以得到定量的结果，如山坳的信号蛋白的ocalization系数。
Protocol
Representative Results
Discussion
多种细胞过程的调节和功能依赖于蛋白质 – 蛋白质相互作用的形成和终止。荧光标记的蛋白质在活细胞显微成像可以实时跟踪。标签的蛋白的共定位，能否提供一个直接或间接的蛋白质之间的相互作用，可以用来加强通过生物化学的方法，如免疫沉淀获得的研究结果。与生化方法不同的是，活细胞成像可以观察这些蛋白间的相互作用空间，随着时间的推移，促进发生的生理过程的监测和检测的蛋?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢索菲亚炸的技术援助。 MBS感谢以下机构为他们的研究支持：以色列科学基金会补助no.1659/08，971/08，1503/08和491/10，没有补助的健康与科学部。 3-4114和3-6540，透过地产已故的亚历山大Smidoda的，以色列癌症协会和Taubenblatt家庭基金会为生物医药的卓越补助。
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
References
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