형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 Cryosectioning
Summary
우리는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰 할 효모 커뮤니티를 동결 cryosectioning을위한 프로토콜을 제시한다. 방법은 메탄올 – 고정에 의존하고 지역 사회 내에서 형광 단백질의 운영을 중지시키지 않고 세포의 공간 분포를 유지하기 위해 월 퍼가기.
Abstract
미생물은 일반적으로 지역 사회에 살고 있습니다. 지역 사회 내에서 세포의 공간적 조직은 지역 사회 (1)의 생존과 기능에 영향을 미칠 것으로되어 있습니다. 공 촛점과 두 광자 현미경 등의 광학 sectioning 기술, 박테리아 및 archaeal 지역 사회 2,3의 공간 조직을 관찰하는 데 유용 입증했습니다. 공 촛점 이미징 및 효모 식민지의 물리적 sectioning의 조합이 세포 4의 내부 조직을 밝혔다. 그러나, 공 촛점 또는 두 광자 현미경을 사용하여 직접 광학 sectioning는 효모 식민지에 깊은 몇 가지 세포 레이어에 도달 할 만 수있었습니다. 이 제한 때문에 효모 세포 4 빛의 강력한 분산의 가능성이 높습니다.
여기, 우리는 고정와 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회 내에서 형광 세포의 공간적 분포를 얻기 위해 cryosectioning에 따라 방법을 제시한다. 우리는 정착액 에이전트로 메탄올을 사용하여세포의 공간적 분포를 유지합니다. 고정 사회는 그라 이오 스탯에 10월 화합물, 냉동 및 cryosectioned으로 침투하고 있습니다. 섹션의 형광 이미징은 지역 사회의 형광 세포의 내부 조직을 드러내고있다.
빨간색과 녹색 형광 단백질을 표현 변종으로 구성된 효모 지역 사회의 예로는뿐만 아니라 효모 식민지 2,3에서 유전자 발현의 같은 형광 세포의 공간 분포를 표시하는 방법 cryosectioning 방법의 가능성을 보여줍니다. 우리의 초점을 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회에있다하더라도, 같은 방법은 잠재적으로 다른 미생물 커뮤니티를 검사하기 위해 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 절차는 효모 지역 사회의 내부 구조를 검사 할 수있는 방법을 제공합니다. 메탄올 고정 단계 8 효모 식민지는 융통성하게하고 식민지의 무결성을 유지하지만, 또한 그 결과를 해석에 고려되어야 수축 8됩니다. 우리는 일반적으로 직접 구를 해결하지 않고 10월에 포함 된 식민지에 비해 효모 식민지의 높이에서 30 %의 수축을 참조하십시오.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그라 이오 스탯을 사용하는 권한에 대해 프레드 허친슨 암 연구 센터의 조나단 쿠퍼 연구소 감사드립니다. 이 작품은 NIH와 WM 중사 님 재단에 의해 지원되었다. BM은 생명 과학 연구 재단의 고든 무어와 베티의 동료입니다. 우리는 우리와의 고정 프로토콜을 공유 다니엘 Gottschling에 감사하고 있습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
Riferimenti
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , (2012).
- Kiernan, J., ed, . Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetica. 184 (3), 707-716 (2010).
