In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali
Summary
Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Un<em> In vivo</em> A due fotoni metodo di imaging è descritto qui che permette il tracciamento di tali alterazioni molecolari nei singoli neuroni corticali attraverso giornalisti geneticamente codificati.
Abstract
La capacità del cervello di cambiare in risposta alle esperienze è essenziale per la funzione cerebrale sano, e anomalie in questo processo contribuiscono a una varietà di disturbi cerebrali 1,2. Per meglio comprendere i meccanismi con cui i circuiti cerebrali reagiscono all'esperienza di un animale richiede la capacità di monitorare i cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti in un dato insieme di neuroni, per un periodo di tempo prolungato, nell'animale vivo. Mentre l'esperienza e le relative attività neurale è noto per innescare cambiamenti di espressione genica nei neuroni 1,2, la maggior parte dei metodi per rilevare i cambiamenti e non consentono l'osservazione ripetuta dei neuroni stessi più di più giorni o non hanno una risoluzione sufficiente per osservare i singoli neuroni 3 , 4. Qui, descriviamo un metodo che combina di due fotoni microscopia in vivo con un giornalista geneticamente codificato fluorescente per monitorare l'esperienza-dipendenti cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni corticali sul corso del giorno per giorno l'esperienza.
Uno dei consolidata esperienza-dipendenti geni è regolata attività proteine del citoscheletro associato (Arc) 5,6. La trascrizione d'Arco è rapidamente e altamente indotta da attività neuronale intensificata 3, e il suo prodotto proteico regola l'endocitosi dei recettori del glutammato e lungo termine plasticità sinaptica 7. L'espressione di Arc è stato ampiamente utilizzato come marcatore molecolare per mappare circuiti neuronali coinvolti in comportamenti specifici 3. Nella maggior parte di questi studi, espressione Arc stata rilevata mediante ibridazione in situ o immunoistochimica in sezioni di cervello fisse. Benché questi metodi ha rivelato che l'espressione di Arc è stato localizzato a un sottoinsieme di neuroni eccitatori, dopo l'esperienza del comportamento, come i modelli cellulari di espressione Arc potrebbe cambiare con episodi multipli di esperienze ripetute o distintivo più giorni non è stato studiato.
S copi "> In vivo a due fotoni microscopia offre un modo efficace per esaminare i cambiamenti cellulari esperienza-dipendenti nel cervello vivente 8,9. Per consentire l'esame di espressione Arc nei neuroni vivi da microscopia a due fotoni, abbiamo precedentemente generato un knock- in linea di topi in cui un reporter GFP è posto sotto il controllo del promotore endogeno Arc 10. Questo protocollo descrive le preparazioni chirurgiche e le procedure di imaging per tracciamento esperienza-dipendenti Arc-GFP espressione modelli in formazioni neuronali nel animale vivo. In questo metodo , croniche finestre del cranio sono stati impiantati in Arc-GFP topi sulle regioni corticali di interesse. Tali animali sono stati quindi più volte ripreso da microscopia a due fotoni dopo desiderati paradigmi comportamentali nel corso di diversi giorni. Questo metodo può essere generalmente applicabili agli animali che trasportano altri reporter fluorescenti di cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti 4.Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo in vivo immagini qui descritto consente l'esame ripetuto di cambiamenti genetici Arc espressione negli stessi gruppi di neuroni più di più giorni in animale vivo. Si tratta di un metodo efficace e versatile per ottenere informazioni sulla dinamica molecolare plasticità neurali legate a singoli neuroni in risposta a varie esperienze comportamentali. Standard metodi istochimici come ibridazione in situ e colorazione può realizzare singola cella di risoluzione 3, ma manca la c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare L. Belluscio per le apparecchiature per la chirurgia riprese, D. Kwon per le riprese di assistenza, K. Liu per il video editing di assistenza, e K. MacLeod per tutta la musica di sottofondo. KW riconosce il generoso sostegno della Divisione NIMH dei programmi di ricerca intramurale e le Geni, Cognizione e Programma psicosi. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale NIMH (VC, YY, SMKW) e la Divisione di NIAAA Intramural programma di ricerca clinica e biologica (VC, RMC, DML).
Materials
| Name of the Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
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