Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em> Drosophila</em> Embryogenese
Summary
Her beskriver vi en effektiv metode til at studere dynamikken i apoptotisk celle clearance<em> In vivo</em>. Denne fremgangsmåde anvender leve<em> Drosophila</em> Embryoner som en stærk model for overvågning fagocytose af apoptotiske celler under anvendelse af specifikke mærkning af apoptotiske celler og fagocytter.
Abstract
Den rette fjernelse af uønskede eller afvigende celler gennem apoptose og efterfølgende fagocytose (apoptotic celle clearance) er afgørende for en normal udvikling i alle metazoiske organismer. Apoptotisk celle clearance er en meget dynamisk proces intimt forbundet med celledød, unengulfed apoptotiske celler er næsten ikke ses in vivo under normale forhold. For at forstå de forskellige trin i apoptotic celle clearance og sammenligne 'professionelle' fagocytter – makrofager og dendritiske celler til "ikke-professionelle" – tissue-hjemmehørende omkringliggende celler, in vivo billeddannelse af processen er yderst værdifuld. Her beskriver vi en protokol for at studere apoptotic celle clearance i levende Drosophila embryoner. At følge dynamikken i forskellige trin i fagocytose vi bruger specifikke markører for apoptotiske celler og fagocytter. Derudover kan vi overvåge to fagocyt systemer i parallel: 'professionelle' makrofager og 'semi-professional 'glia i udviklingslandene centralnervesystemet (CNS). Den her beskrevne metode anvender Drosophila embryo som en fremragende model for tidstro studier af apoptotic celle clearance.
Introduction
Den rette fjernelse af uønskede eller afvigende celler gennem apoptose og efterfølgende fagocytose er afgørende for embryonale udvikling samt vævshomeostase i den voksne. Fagocytose af apoptotiske celler eller apoptotisk celle clearance er en meget dynamisk proces, der forløber i fire trin: (1) ansættelse af fagocytter til apoptotiske celle ('find-mig "), (2) anerkendelse af cellen som et mål for fagocytose ( 'spise mig "), og (3) engulfment, efterfulgt af (4) fagosomet modning og nedbrydning af apoptotiske partikel 1-5. Der er to typer af fagocytter: 'professionelle' makrofager og umodne dendritiske celler, og "ikke-professionelle" tissue-hjemmehørende omkringliggende celler, som er afgørende for apoptotic celle clearance under metazoan udvikling 6,7.
I Drosophila udvikling, sker fjernelsen af overflødige celler gennem apoptose i tre main faser, først i midten til slutningen af embryo, og derefter i midten puppe, og igen i den tidlige voksen. Under embryogenese apoptotiske partikler fjernes ved 'professionelle' fagocytter, makrofager, og af den "ikke-professionelle" ectoderm og glia 8,9.
I vores tidligere arbejde har vi identificeret en fagocytisk receptor, Six-mikron-under (SIMU), som udelukkende udtrykkes i fagocyterende celler under embryogenese. Brug af simu promotor vi genereret en specifik markør for fagocytiske cellepopulationer (simulere cytGFP), som gør os i stand til at overvåge makrofager, ectoderm og glia samtidig i en live embryo under udvikling 8.. Derudover, ved anvendelse af specifikke markører for apoptotiske celler i forskellige stadier af apoptose vi er i stand til at følge dynamikken i apoptotisk celle clearance in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptotisk celle clearance er en kritisk sidste stadie af apoptose, som er meget dynamisk. Derfor realtid undersøgelser af processen er af allerstørste betydning. Her beskriver vi en protokol, der muliggør overvågning af apoptotic celle clearance i levende udviklingslandene Drosophila embryoner. I denne procedure, skal to populationer af celler mærkes med specifikke markører: apoptotiske celler og fagocytter. Den simu-cytGFP reporter er egnet til overvågning fagocytiske makrofager, glia og ectod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et Marie Curie reintegrationsstipendium (IRG249084). Vi takker alle medlemmer af Kurant laboratorium.
Materials
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush |
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can’t eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
