Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em> Drosophila</em> Embryogenese
Summary
Her beskriver vi en effektiv metode for å studere dynamikken i apoptotiske cellen klaring<em> In vivo</em>. Denne metoden benytter leve<em> Drosophila</em> Embryoer som en kraftig modell for overvåking fagocytose av apoptotiske celler ved hjelp av spesifikk merking av apoptotiske celler og phagocytes.
Abstract
Riktig eliminering av uønskede eller avvikende celler gjennom apoptose og påfølgende phagocytosis (apoptotiske celle clearance) er avgjørende for normal utvikling i alle metazoan organismer. Apoptotiske celle clearance er en svært dynamisk prosess nært forbundet med celledød; unengulfed apoptotiske celler er knapt sett in vivo under normale forhold. For å forstå de ulike trinnene i apoptotiske cellen klarering og sammenligne "profesjonell" fagocytter – makrofager og dendrittiske celler til "ikke-profesjonelle" – vev-resident nabocellene, in vivo levende avbildning av prosessen er meget verdifull. Her beskriver vi en protokoll for å studere apoptotiske celle klaring i levende Drosophila embryoer. Å følge dynamikken i forskjellige trinnene i fagocytose vi bruker spesifikke markører for apoptotiske celler og phagocytes. I tillegg kan vi overvåke to phagocyte systemer i parallell: "profesjonell" makrofager og "semi-professional 'gliaceller i den tredje sentrale nervesystemet (CNS). Metoden beskrevet her benytter Drosophila embryo som en utmerket modell for sanntids studier av apoptotisk celle klaring.
Introduction
Riktig eliminering av uønskede eller avvikende celler gjennom apoptose og påfølgende phagocytosis er avgjørende for embryonal utvikling så vel som for vev homeostase i voksen. Fagocytose av apoptotiske celler eller apoptotiske celle klaring er en svært dynamisk prosess som fortsetter i fire trinn: (1) rekruttering av fagocytter til apoptotiske cellen ('finne-meg "), (2) anerkjennelse av cellen som et mål for fagocytose ( 'spise-me') og (3) engulfment, etterfulgt av (4) phagosome modning og nedbrytningen av apoptotiske partikkel 1-5. Det finnes to typer av fagocytter: "profesjonell" makrofager og umodne dendrittiske celler, og "ikke-profesjonelle 'vev-resident nabocellene, som er avgjørende for apoptotiske celle klaring under metazoan utvikling 6,7.
I Drosophila utvikling, skjer eliminering av overflødige celler gjennom apoptose i tre main faser, først i midten til slutten av embryo, deretter i midten av puppe, og igjen i tidlig voksen. Under embryogenese apoptotic partiklene er fjernet av "profesjonell" fagocytter, makrofager, og av de "ikke-profesjonell" ectoderm og gliaceller 8,9.
I vårt tidligere arbeid har vi identifisert en fagocytisk reseptor, Six-mikron-under (SIMU), som uttrykkes utelukkende i fagocyttiske celler under embryogenese. Ved hjelp av simulatoren promoter vi generert en spesifikk markør for fagocyttiske celle populasjoner (simulere cytGFP) som gjør oss i stand til å overvåke makrofager, ectoderm og gliaceller samtidig i en live utvikling av embryo 8. I tillegg, ved hjelp av spesifikke markører for apoptotiske celler i ulike stadier av apoptose, er vi i stand til å følge dynamikken i apoptotiske cellen klaring in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptotisk celle klaring er en kritisk siste stadium av apoptose, noe som er svært dynamisk. Derfor sanntid studier av prosessen er av største betydning. Her beskriver vi en protokoll som muliggjør overvåkning av apoptotiske celle klaring i levende utviklingsland Drosophila embryoer. I denne fremgangsmåte må to populasjoner av celler merkes med spesifikke markører: apoptotiske celler og fagocytter. De simu-cytGFP reporter er egnet til å overvåke fagocytiske makrofager, gliaceller og Ektoderm s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en Marie Curie Reintegrering Grant (IRG249084). Vi takker alle medlemmer av Kurant laboratoriet.
Materials
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush |
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can’t eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
