Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em> Drosophila</em> Embryogenesis
Summary
Här beskriver vi en effektiv metod för att studera dynamiken i apoptotisk cell clearance<em> In vivo</em>. Denna metod använder bor<em> Drosophila</em> Embryon som en kraftfull modell för övervakning fagocytos av apoptotiska celler med särskild märkning av apoptotiska celler och fagocyter.
Abstract
Den korrekt eliminering av oönskade eller avvikande celler genom apoptos och efterföljande fagocytos (apoptotiska celler clearance) är avgörande för normal utveckling i alla flercelliga organismer. Apoptotisk cell clearance är en mycket dynamisk process intimt förknippade med celldöd, unengulfed apoptotiska celler knappt sett in vivo under normala förhållanden. För att förstå de olika stegen i apoptotiska celler clearance och jämföra "professionella" fagocyter – makrofager och dendritiska celler till "icke-professionell" – vävnad bosatta angränsande celler, in vivo levande avbildning av processen är oerhört värdefull. Här beskriver vi ett protokoll för att studera apoptotiska celler clearance i levande Drosophila embryon. För att följa dynamiken i olika steg i fagocytos vi använder specifika markörer för apoptotiska celler och fagocyter. Dessutom kan vi följa två phagocyte system parallellt: "professionella" makrofager och "semi-professional 'Glia i utvecklingsländerna centrala nervsystemet (CNS). Den metod som beskrivs här använder Drosophila embryot som en utmärkt modell för verkliga tidsstudier av apoptotiska celler avslut.
Introduction
Den korrekt eliminering av oönskade eller avvikande celler genom apoptos och efterföljande fagocytos är avgörande för embryonal utveckling samt för vävnad homeostas i den vuxna. Fagocytos av apoptotiska celler eller apoptotiska celler clearance är en mycket dynamisk process som sker i fyra steg: (1) rekrytering av fagocyter till apoptotiska celler ("hitta-mig"), (2) erkännande av cellen som ett mål för fagocytos ( "äta-me ') och (3) helt omslutande följt av (4) phagosome mognad och nedbrytning av den apoptotiska partikeln 1-5. Det finns två typer av fagocyter: "professionella" makrofager och omogna dendritiska celler, och den "icke-professionella" tissue hemmahörande angränsande celler, vilket är avgörande för apoptotiska celler clearance under metazoan utveckling 6,7.
I Drosophila utveckling sker eliminering av överflödiga celler genom apoptos i tre main faser, först i mitten eller slutet av embryo, sedan i mitten av puppa, och igen i tidig vuxen. Under fosterutvecklingen apoptotiska partiklar avlägsnas genom "professionella" fagocyter, makrofager, och av "icke-professionell" ektoderm och glia 8,9.
I vårt tidigare arbete har vi identifierat ett fagocytisk receptor, Six-mikron-under (SIMU), vilket uttrycks enbart i fagocytiska celler under fosterutvecklingen. Använda simu promotorn vi genererat en specifik markör för fagocytiska cell populationer (simu-cytGFP) vilket gör att vi kan övervaka makrofager, ektoderm och glia samtidigt i ett levande embryo under utveckling 8. Dessutom, genom att använda särskilda markörer för apoptotiska celler i olika stadier av apoptos, kan vi följa dynamiken i apoptotiska celler clearance in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptotisk cell clearance är en kritisk sista stadiet av apoptos, vilket är mycket dynamisk. Därför realtid studier av processen är av yttersta vikt. Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör övervakning av apoptotiska celler clearance i levande utvecklingsländer Drosophila embryon. I den här proceduren måste två populationer av celler märkas med specifika markörer: apoptotiska celler och fagocyter. Den simu-cytGFP reportern är lämplig för övervakning av fagocytiska makrofager, gl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett Marie Curie återintegreringsbidrag (IRG249084). Vi tackar alla medlemmar i Kurant laboratoriet.
Materials
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush |
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can’t eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
