Identifizierung von<em> Dornröschen</em> Transposon Insertionen in Solid Tumors mit Linker-vermittelte PCR
Summary
Verfahren zur Identifizierung unbekannter Fahrer von Karzinogenese Verwendung eines unvoreingenommene Ansatz beschrieben. Das Verfahren verwendet das<em> Dornröschen</em> Transposon als eine zufällige Mutagen auf spezifische Gewebe. Genomic Mapping von Transposon-Insertionen, die Tumorbildung zu fahren identifiziert neue Onkogene und Tumor-Suppressor-Gene
Abstract
Genomik, Proteomik, Transkriptom und epigenomischen Analysen von menschlichen Tumoren zeigen, dass es Tausende von Anomalien innerhalb der einzelnen Krebs-Genom im Vergleich zum angepassten normalem Gewebe. Basierend auf diesen Untersuchungen ist es offensichtlich, dass es viele unentdeckte genetischen Fahrer von Krebs ein. Leider sind diese Treiber sind in einer viel größeren Anzahl von Personen Anomalien im Genom, die nicht direkt zur Tumorbildung beitragen versteckt. Ein weiterer Aspekt der Krebsgenoms ist, dass es erhebliche genetische Heterogenität innerhalb ähnlicher Tumorarten. Jeder Tumor kann beherbergen verschiedene Mutationen, die einen selektiven Vorteil für die Tumorbildung 2 bereitzustellen. Durchführen eines unvoreingenommene vorne genetischen Screen bei Mäusen liefert die Werkzeuge, um Tumore zu generieren und zu analysieren, ihre genetische Zusammensetzung, bei gleichzeitiger Reduzierung der Hintergrund der Passagier Mutationen. The Sleeping Beauty (SB) Transposonsystem ist eine solche Methode 3. Das SB-System nutzt mobilen vektoren (Transposons), die über das Genom von der Transposase-Enzym eingesetzt werden kann. Mutationen werden auf einen bestimmten Zelltyp durch die Verwendung eines bedingten Transposase-Allel, die durch Cre-Rekombinase aktiviert ist begrenzt. Viele Mauslinien bestehen, dass ausdrückliche Cre-Rekombinase in bestimmten Geweben. Durch die Kreuzung eine dieser Leitungen zu dem bedingten Transposase Allels (zB Lox-Stop-Lox-SB11) wird der SB-System nur in Zellen, die Cre-Rekombinase ausdrückliche aktiviert. Die Cre-Rekombinase wird verbrauchsteuerpflichtigen einen Anschlag Kassette dass Blöcke Expression der Transposase-Allel und aktiviert damit Transposon-Mutagenese innerhalb der bezeichneten Zelltyp. Ein SB-Bildschirm wird durch Züchtung drei Stämmen von transgenen Mäusen eingeleitet, so dass die experimentelle Mäuse eine bedingte Transposase-Allel, ein Konkatamer von Transposons, und einen Gewebe-spezifischen Rekombinase Cre-Allel tragen. Diese Mäuse sind auf das Alter, bis die Tumoren Form erlaubt und werden sie verenden. Die Mäuse werden dannseziert und genomische DNA wird aus den Tumoren isoliert. Als nächstes wird die genomische DNA-Linker-vermittelten-PCR unterzogen (LM-PCR), die zu Amplifikation von genomischen Loci, die ein Transposon SB. LM-PCR durchgeführt auf einem einzigen Tumor in Hunderten von verschiedenen Amplikons, die die Hunderte von genomischen Loci mit Transposon-Insertionen in einem Tumor 4 führen. Die Transposon-Insertionen in allen Tumoren analysiert und gemeinsame Insertionsstellen (CISS) identifiziert werden unter Verwendung eines geeigneten statistischen Methode 5. Gene innerhalb der GUS sind sehr wahrscheinlich Onkogene oder Tumor-Suppressor-Gene, und gelten als Kandidaten Krebsgene. Die Vorteile der Verwendung des Systems, um Kandidaten SB Krebsgene identifiziert sind: 1) das Transposon kann leicht im Genom lokalisiert werden, weil seine Sequenz bekannt ist, 2) die Umsetzung kann auf nahezu jeden Zelltyp gerichtet sein und 3) das Transposon in der Lage ist Einführung sowohl Gewinn-und Verlust-of-function Mutationen 6. Die following Protokoll beschreibt, wie die Entwicklung und Umsetzung eine vorausschauende genetische Bildschirm mit dem SB Transposon System Kandidaten Krebsgene (Abbildung 1) zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine vorausschauende genetische Bildschirm mit dem Dornröschen Transposon-System bietet eine Methode zur Identifizierung von Mutationen, die Krebs verursachen. Durch Auswahl des geeigneten Promotors mit Cre-Rekombinase zusätzlich zu irgendwelchen Mutationen prädisponierende steuern, wird der Bildschirm zu identifizieren SB bekannten und neuartigen Kandidaten Krebsgene.
Der Erfolg einer SB-Bildschirm ist weitgehend abhängig von den Mäusen für die Erstellung des Bildsch…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Branden Moriarity, David Largaespada und Vincent Keng an der University of Minnesota danken und Adam Dupuy an der University of Iowa für ihre Unterstützung bei der Entwicklung des oben beschriebenen Protokoll.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
Riferimenti
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
