Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de
Summary
Existe un creciente interés en la comprensión de las funciones inmunológicas de subpoblaciones específicas de células en las placas de Peyer (PP), los sitios primarios de inducción de los tejidos linfoides asociados al intestino. Aquí resumimos los protocolos paralelos para preparar PP preparativos de célula única para el análisis de citometría de flujo y cryosections PP para inmunoticción.
Abstract
Placas de Peyer (PP) son componentes integrales de los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT) y desempeñan un papel central en la vigilancia inmunológica intestinal y la homeostasis. Antígenos particulados y los microbios en el lumen intestinal son continuamente muestreados por células M del PP en el epitelio del folículo asociado (FAE) y se transporta a una red subyacente de células dendríticas (DCs), macrófagos, y linfocitos. En este artículo, se describen protocolos en la que PP murinos son (i) disociaron en suspensiones de células individuales y se sometieron a citometría de flujo y (ii) preparado para crioseccionamiento y inmunotinción. Para citometría de flujo, los PP son disociaron mecánicamente y después se filtró a través de membranas de 70 micras para generar suspensiones de células individuales libres de células epiteliales y los desechos grandes. Comenzando con 20-25 pps (de cuatro ratones), este método rápido y reproducible permite obtener una población de> 2,5 x 10 6 células con> 90% la viabilidad celular. Para cryosectioning, frescoPPs ly aislados se sumergen en una temperatura óptima de corte (OCT) medio, snap-congelado en nitrógeno líquido, y luego seccionado utilizando un criomicrotomo. Las secciones de tejido (5-12 micras) se secan al aire, se fijaron con acetona o metanol, y después se somete a inmunomarcaje.
Introduction
Placas de Peyer (PP) son agregados macroscópicos de organizados folículos linfoides presentes en todo el intestino delgado de los seres humanos y ratones (Figura 1) y que constituyen los sitios primarios en el que respuestas inmunes mucosales son iniciadas contra antígenos de la dieta, las bacterias comensales, agentes patógenos, y vacunas orales 1-4. A diferencia de otros tejidos linfoides periféricos, tales como los ganglios linfáticos mesentéricos, PP carecen de vasos linfáticos aferentes. Como tales, las respuestas inmunes adaptativas en EPA son accionados en respuesta a antígenos derivados de la luz intestinal. La toma de muestras de antígenos luminales se lleva a cabo por el epitelio del folículo-asociado (FAE), que consta tanto de los enterocitos y células de muestreo de antígeno conocidas como células M. Debajo de la FAE, en la cúpula de sub-epitelial (SED) región, se encuentra una red de células dendríticas (DCs), entremezcladas con los macrófagos, células B, y células T CD4 + 5-9. En el núcleo de cada follicl linfoide PPe son células dendríticas foliculares (CDF) y una rica en células B del centro germinal central, flanqueado por zonas interfoliculares T rico en células. Muestreo de antígeno por los resultados de PPS en el desarrollo de IgA plasmablasts celulares + B y las células CD4 + efectoras y de memoria que la semilla de la propia lámina circundante y proporcionar inmunidad contra una amplia variedad de invasores mucosas.
Disección de los eventos inmunológicos complejos asociados con el muestreo de antígeno, la elaboración y presentación de los PP es una tarea de enormes proporciones, considerando que las células PP constituyen sólo una pequeña fracción del total de células linfoides en la mucosa intestinal. Para ayudar en la caracterización in vitro de las células en este medio, se proporciona un protocolo para la preparación total de células de ratón PP para el análisis de citometría de flujo y funcionales, así como un protocolo para la preparación de PP criosecciones para microscopía de inmunofluorescencia y inmunohistología. Nuestro protocolo para el aislamiento, caracterización y inmunotinción de mouse las células del PP no es nueva en sí misma, como lo demuestra el hecho de que hay numerosas referencias datan de hace más de 25 años que citan estas técnicas 5,6,9-11. Más bien, el protocolo proporciona un aerodinámico (y visual) método para investigadores recogida PPs por primera vez. Las técnicas descritas se domina fácilmente y producir fácilmente grandes cantidades de células con> 90% la viabilidad celular. El protocolo cryosectioning produce secciones en serie altamente reproducibles idealmente adecuados para la tinción de inmunofluorescencia y la imagen confocal. Por otra parte, el protocolo complementa otros dos artículos recientes Jove. El primero, por Fukuda et al, describe el uso de ensayos de ligadura del asa ileal para evaluar la absorción de las bacterias patógenas por células M del PP 12. La otra, por Geem y colegas, describe el aislamiento y caracterización de las DCs y macrófagos de la mucosa intestinal del ratón, pero excluye explícitamente PPs de su análisis 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, hemos proporcionado protocolos paralelos para preparar PP preparaciones de células individuales para el análisis de citometría de flujo y funcional y cryosections para inmunotinción. Ambos métodos son altamente reproducible y fácilmente accesible, siempre un citómetro de flujo y el criostato están disponibles. Para los investigadores por primera vez hay que señalar que, en comparación con el bazo, los rendimientos totales de células de PP son relativamente escasos. Sin embargo, el protocolo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a la canción Renjie (Wadsworth Center Flow Core Citometría) para la asistencia en el análisis celular y Helen Johnson (Wadsworth Center Animal Histopatología Core) para la preparación de secciones de parafina. Agradecemos al Dr. Richard A. Cole (Wadsworth Center Light Microscopy Core) para obtener ayuda con la microscopía confocal y la colección de imágenes. Nos gustaría reconocer Andy Bentley (Wadsworth Photo Center y la Ilustración) para obtener ayuda con animaciones.
MDJ con el apoyo de la Fundación para la Investigación Ciencias de la Vida, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA se apoya en un Wadsworth Center-Health Research Fellowship Inc. postdoctoral intramural. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH y HD061916 GM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
Riferimenti
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