Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino
Summary
Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.
Abstract
Placas de Peyer (PP) são componentes integrais dos tecidos linfóide associado ao intestino (GALT) e desempenham um papel central na imunovigilância intestinal e homeostase. Antigénios particulados e micróbios no lúmen intestinal estão continuamente sujeitos a amostragem por células PP M no epitélio folicular-associado (FAE) e transportado para uma rede de base de células dendríticas (DC), macrófagos, linfócitos e. Neste artigo, descreve protocolos em que PPs murinos são (i) dissocia-se em suspensões de células isoladas e sujeitas a citometria de fluxo, e (ii) preparado para cryosectioning e imunocoloração. Para a citometria de fluxo, PPs são dissociadas mecanicamente e em seguida filtrada através de membranas 70 uM para gerar suspensões de células individuais livres de células epiteliais e os detritos de grandes dimensões. Começando com 20-25 PPs (a partir de quatro ratinhos), esse método rápido e reproduzível origina uma população de> 2,5 x 10 6 células, com> 90% de viabilidade celular. Para cryosectioning, frescoPPs ly isoladas estão imersos em meio de corte ideal de temperatura (OCT), congelado em nitrogênio líquido, e seccionados usando um cryomicrotome. As secções de tecido (5-12 mm) são secas ao ar, fixadas com acetona ou metanol, e, em seguida, submetido a imunomarcação.
Introduction
Placas de Peyer (PP) são agregados macroscópicos de organizados folículos linfóides presentes em todo o intestino delgado dos humanos e ratos (Figura 1) e que constituem os sítios primários em que mucosas respostas imunes são iniciadas contra antígenos alimentares, bactérias comensais, agentes patogénicos microbianos e vacinas orais 1-4. Ao contrário de outros tecidos linfóides periféricos, como os linfonodos mesentéricos, PPs não têm vasos linfáticos aferentes. Como tal, as respostas imunes adaptativas em PPs são accionados em resposta a antigénios derivados a partir do lúmen intestinal. A amostragem de antigénios luminais é realizado pelo epitélio do folículo-associado (FAE), que consiste em dois enterócitos e antigénio-amostragem células conhecidas como células M. Abaixo da FAE, na cúpula sub-epitelial (SED) região, encontra-se uma rede de células dendríticas (CDs) misturavam-se com macrófagos, células B e células T CD4 + 5-9. No centro de cada follicl PP linfóidee são células dendríticas foliculares (FDC) e uma de células B rico centro centro germinal, ladeada por zonas de célula T ricos interfoliculares. Amostragem de antigénio por PPs resulta no desenvolvimento de IgA + plasmablasts de células B e as células CD4 + efectoras e de memória que a semente da lâmina envolvente e proporcionar imunidade a uma grande variedade de invasores mucosas.
Dissecando os eventos imunológicos complexos associados à amostragem antígeno, tratamento e apresentação em PPC é uma tarefa difícil, considerando-se que as células PP constituem apenas uma pequena fração do total de células linfóides na mucosa intestinal. Para ajudar na caracterização in vitro de células neste meio, é proporcionado um protocolo para a preparação de células totais de PP de rato para a análise de citometria de fluxo e funcionais, bem como um protocolo para a preparação de PP criocortes para microscopia de imunofluorescência, e imunohistologia. O protocolo para o isolamento, caracterização e imunocoloração de mouscélulas E PP não é novidade, por si só, como evidenciado pelo fato de que há inúmeras referências datam mais de 25 anos que citam estas técnicas 5,6,9-11. Em vez disso, nosso protocolo fornece um método (e visual) simplificado para investigadores coleta PPs pela primeira vez. As técnicas aqui descritos são facilmente dominado e prontamente produzir grandes números de células com> 90% de viabilidade celular. O protocolo cryosectioning rende altamente reprodutíveis de secções seriadas idealmente adequadas para a coloração de imunofluorescência e de imagem confocal. Além disso, o nosso protocolo complementa dois outros artigos de Jove recentes. O primeiro, por Fukuda e colaboradores, descreve a utilização de ensaios de ligadura de laço ileal para avaliar a absorção de bactérias patogénicas em células PP M 12. O outro, pelo GEEM e colaboradores, descreve o isolamento e caracterização de DCs e macrófagos da mucosa intestinal do rato, mas exclui explicitamente PPs da sua análise 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, nós fornecemos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e funcional e criosseções para a imunocoloração. Ambos os métodos são altamente reprodutível e facilmente acessível, na condição de um citómetro de fluxo e criostato estão disponíveis. Para os investigadores primeira vez deve-se sublinhar que, quando comparado com o baço, o rendimento total de células de PPs são relativamente escassas. No entanto, o protocolo des…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Renjie Song (Wadsworth Centro Núcleo de Citometria de Fluxo) para assistência na análise de células e Johnson Helen (Wadsworth centro animal Histopatologia Core) para a preparação de parafina. Agradecemos ao Dr. Richard A. Cole (Wadsworth Centro Núcleo de Microscopia de luz) para a assistência com microscopia confocal e coleção de imagens. Nós gostaríamos de agradecer Andy Bentley (Wadsworth Center Foto e Ilustração) para assistência com animações.
MDJ é apoiado pela Fundação de Pesquisa de Ciências da Vida, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA é suportado por um Centro de Pesquisa em Saúde-Wadsworth Inc. comunhão intramural de pós-doutorado. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH HD061916 e GM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
Riferimenti
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