2-occlusione di vasi / Ipotensione: un modello di ratto di Global Ischemia cerebrale

Summary

Occlusione carotidea bilaterale accoppiato con ipotensione sistemica produce ischemia cerebrale globale nel ratto, con conseguenti danni al dell'ippocampo con severità riproducibile. Soggetti animali sono compromesse con modelli prevedibili di danni cerebrali, si riprendono speditamente, ed i tassi di mortalità sono relativamente bassi.

Abstract

Seguita da arresto cardiaco rianimazione provoca spesso danni cerebrali causati da ischemia drammatico e successiva riperfusione del cervello. Ischemia globale cerebrale produce danni a regioni specifiche del cervello dimostrato di essere molto sensibile all'ischemia ^1. Neuroni dell'ippocampo hanno una maggiore sensibilità agli insulti ischemici rispetto ad altre popolazioni cellulari, e in particolare, la regione CA1 dell'ippocampo è particolarmente vulnerabile ad ischemia / riperfusione ^2.

La progettazione di interventi terapeutici, o studio dei meccanismi coinvolti nel danno cerebrale, richiede un modello che produce danni simile alla condizione clinica e in modo riproducibile. Carotidea bilaterale occlusione nave con ipotensione (2VOH) è un modello che produce ischemia reversibile prosencefalo, emulando gli eventi cerebrali che possono verificarsi durante l'arresto cardiaco e rianimazione. Descriviamo un modello modificato da Smith et al. (1984) ², Come prima presentata nella sua forma attuale nel Sanderson et al. (2008) ^3, che produce lesioni riproducibile per selettivamente regioni cerebrali vulnerabili ^3-6. L'affidabilità di questo modello è dettata da un controllo preciso della pressione arteriosa sistemica durante ipotensione applicata, la durata dell'ischemia, controllo della temperatura, un regime specifico anestesia, e diligente cura post-operatoria. Un insulto ischemico 8 minuti produce la morte cellulare di neuroni CA1 dell'ippocampo che progredisce nel corso di 6-24 ore di riperfusione, mentre le regioni del cervello meno vulnerabili sono risparmiati. Questa progressiva morte cellulare è quantificato facilmente dopo 7-14 giorni di riperfusione, come una perdita completa presso neuroni CA1 è evidente in questo momento.

In aggiunta a questo modello di lesione cerebrale, presentiamo un metodo per la quantificazione CA1 danni utilizzando un semplice, ma approfondita, metodologia. Importante, quantificazione può essere realizzata utilizzando un microscopio semplice telecamera montata, unaDa Free ImageJ (NIH) software plugin, ovviando alla necessità di programmi software stereologia costo proibitivo e un palcoscenico microscopico motorizzato per la valutazione dei danni.

Introduction

Danni cerebrali a seguito di arresto cardiaco e di ictus è una delle principali cause di morte e disabilità a lungo termine. Mentre rianimazione cardiopolmonare per le vittime di arresto cardiaco riesce a ripristinare la circolazione spontanea in circa 70.000 pazienti all'anno negli Stati Uniti ^7,8 per almeno il 60% di questi pazienti muore successivamente in ospedale a causa di gravi danni cerebrali e solo il 3-10% di pazienti rianimati possono riprendere la loro ex stili di vita ^9,10. Chiaramente, la comprensione dei meccanismi che portano a danni cerebrali a seguito di ischemia cerebrale globale e la progettazione di interventi terapeutici per ridurre al minimo il trauma neurologico è di importanza critica.

Cervello ischemia può essere modellato utilizzando più metodi. Più comunemente, ischemia cerebrale è prodotto nel roditore occludendo un vaso sanguigno nel cervello, l'arteria cerebrale media, producendo così un ictus ischemico focale ^11,12. Mentre clinicamente importante,ischemia cerebrale focale non è un metodo accurato per studiare i danni cerebrali prodotte da arresto cardiaco / rianimazione. Per modellare questo paradigma clinico l'intera testa deve essere fatta ischemica seguita da reintroduzione del flusso sanguigno. Per imitare da vicino questa presentazione clinica, gli investigatori sperimentalmente inducono arresto cardiaco seguito da rianimazione con RCP e defibrillazione ^13,14. Questo modello è clinicamente rilevante, i tempi di rianimazione comunque imprevedibili possono aumentare la variabilità e possono rendere l'analisi dei dati di difficile interpretazione. Inoltre, questo modello è associata ad un alto tasso di mortalità, aumentando ulteriormente il numero degli animali necessari per verificare un'ipotesi. Indagare la risposta cerebrale a ischemia globale e / o di riperfusione in un insulto più riproducibile, coerente, e sopravvivere può essere preferito.

Ischemia globale può essere indotta nel cervello preservando certo flusso sanguigno sistemicamente. Questo riduce la mortalità, pur consentendo investigation dei meccanismi di danno tissutale nel cervello ^2. Per produrre ischemia cerebrale globale, è necessario interrompere o limitare notevolmente il flusso in tutte e quattro vasi che alimentano il cervello, le arterie carotidi interne e le arterie vertebrali. Queste navi forniscono il cervello con il flusso di sangue attraverso una struttura vascolare chiamata Circolo di Willis, che forma un loop anastomotica. Questa architettura vascolare permette al cervello di conservare perfusione in caso di occlusione vascolare prossimale. Pertanto, per indurre ischemia completa del cervello, flusso di sangue attraverso tutti i vasi contributiva deve avvenire. Occlusione dell'arteria carotide può essere realizzata utilizzando un mininvasiva collo ventrale cut-down e l'applicazione di clip aneurisma per un periodo desiderato. Interruzione del flusso sanguigno attraverso le arterie vertebrali può essere difficile, in quanto sono incased nella forami trasversale della colonna vertebrale. Gli investigatori hanno affrontato questo electrocauterizing le arterie vertebrali 24-48 ore prima della carotideocclusione e ischemia cerebrale (4VO modello) ^15. In contrasto con questo approccio, Smith et al. Sviluppato un metodo per indurre ischemia cerebrale globale riducendo la pressione arteriosa media (MAP) sistemicamente a 40 mmHg per ridurre la perfusione attraverso le arterie vertebrali ad un punto in cui il flusso di sangue è perso o fortemente ridotta ² . Quando accoppiato con occlusione carotidea, questo metodo produce ischemia tutto il proencefalo, risultante in un modello di danno cerebrale che imita da vicino quella di sopravvissuti arresto cardiaco. In un ulteriore perfezionamento di questo metodo, il modello che presentiamo qui necessita di regolamentazione MAPPA stretto a 30 mmHg ± 1mHg durante l'intero 8 min di ischemia. Abbiamo trovato questa alterazione migliora la riproducibilità del danno cerebrale indotto da questo modello, preservando il basso tasso di mortalità della tecnica originale disegnato da Smith et al.

Il fenotipo precisa della morte cellulare e l'entità complessiva del danno tissutale causato dail modello presentato qui sono direttamente dipendenti durata ischemica ^16. Seguendo 8 minuti di ischemia, neuroni CA1 esibiscono ritardato morte cellulare, suggerendo che vi sia una finestra temporale di intervento terapeutico durante la fase di riperfusione ^15,17. All'inizio della riperfusione, i neuroni riacquistano rapidamente la funzione e non la morte cellulare immediato è rilevabile ^18. Tuttavia questo insulto provoca l'induzione di cascate di morte cellulare (apoptosi) che culminano nel rilascio di proteine ​​apoptogenica dai mitocondri, tra cui il citocromo c, tra 4-6 ore di riperfusione ^3,19. Tra il 6 e 24 ore di riperfusione, i neuroni del CA1 dell'ippocampo sono impegnati a morte cellulare, e il programma di morte cellulare per apoptosi viene eseguito ^19. Va notato che la morte delle cellule fenotipo responsabile del danno ischemico è molto controverso. I primi studi hanno suggerito la necrosi è il primario morte cellulare fenotipo ^20,21, mentre altri altri riferiscono apoptOsis come il meccanismo principale ^22,23. In totale, le prove attuali suggeriscono che le cellule muoiono di uno spettro di fenotipi di morte cellulare che vanno dal classico al apoptosi necrosi. Della specifica modalità di morte cellulare dipende da molti fattori, con il grado di contributo di ciascun fenotipo seconda della gravità dell'insulto, tra gli altri fattori ^24,25. Con 24 ore di riperfusione, le cellule muoiono possiedono nuclei picnotici, citosol condensato con chiara evidenza di contenuti aggregati cellulari, e la perdita della morfologia funzionale mitocondriale. Le cellule morte sono ulteriormente suddivise, inghiottiti da cellule del sistema immunitario come i macrofagi e / o microglia, e liquidati dalla regione CA1 dell'ippocampo. Da 4-7 giorni di riperfusione, le cellule morte vengono rimosse, e tutto ciò che rimane sono le cellule infiammatorie e cellule gliali attivate ^17,26. Pertanto, 7 giorni di riperfusione rappresenta un momento ottimale in cui CA1 dell'ippocampo morte neuronale può essere quantificato utilizzando semplici macchie di cellule non-specifici, including violetto cresolo o hemotoxylin-eosina e contato sulla base di criteri di inclusione morfologici. Le cellule rimanenti in questo intervallo di riperfusione tardiva possono essere considerate come cellule sopravvissute, fornendo così un indice di danno cerebrale.

Se questo modello deve essere utilizzato per testare gli interventi terapeutici, si suggerisce che il disegno sperimentale seguire criteri SCALE (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) ^27. Queste linee guida dovrebbero essere seguite durante la progettazione e la realizzazione di uno studio, tuttavia, non sono discussi qui.

Protocol

1. Preparazione Tutti gli esperimenti sugli animali devono essere conformi alle linee guida istituzionali e ricevere l'approvazione da parte di una commissione di competenza la cura degli animali prima di iniziare. Tutte le procedure qui presentati sono stati approvati dalla Wayne State University Institutional Animal Care e uso Comitato e seguire le linee guida per il trattamento etico degli animali, come messo avanti nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e di Gove…

Representative Results

Il modello 2VOH di ischemia cerebrale / riperfusione globale provoca la morte neuronale nella regione CA1 dell'ippocampo. Figura 2 rappresenta la lesione prodotta da 8 minuti di ischemia cerebrale globale, trasformati 14 giorni dopo la riperfusione. Figure 2A e 2B confronta ippocampi da sham e cervelli post-ischemica, colorate con violetto cresolo. Figura 2A mostra un ippocampo di un topo sham-operated che presenta normale morfologia, tra cui un CA1…

Discussion

Il modello qui descritto produce un insulto ischemico al cervello che può verificarsi come risultato di arresto cardiaco e rianimazione, fornendo un infortunio simile a quella trovata in esseri umani. Questo metodo per produrre ischemia cerebrale globale è una delle più protocolli. Utilizziamo questo protocollo soprattutto per il suo tasso relativamente basso di mortalità, recupero rapido e risultati riproducibili. Il modello di arresto / rianimazione cardiaca è probabilmente il modello più clinicamente rilevante,…

Materials

			Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
			Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
			Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
			Software
ImageJ	NIH