Bilateral carotis okklusion kombineret med systemisk hypotension producerer global hjerneiskæmi i rotter, hvilket resulterer i skader på hippocampus med reproducerbare sværhedsgrad. Animal fag er svækket med forudsigelige mønstre af hjerneskade, de kommer sig hensigtsmæssigt, og dødeligheden er forholdsvis lav.
Hjertestop efterfulgt af genoplivning ofte resulterer i en dramatisk hjerneskade forårsaget af iskæmi og efterfølgende reperfusion af hjernen. Globale hjerneiskæmi producerer skade på bestemte områder af hjernen har vist sig at være meget følsomme over for iskæmi 1. Hippocampale neuroner har højere følsomhed til iskæmiske fornærmelser forhold til andre cellepopulationer, og specifikt, CA1-regionen af hippocampus er særligt udsatte for iskæmi / reperfusion 2.
Udformningen af terapeutiske interventioner, og til undersøgelse af mekanismer involveret i cerebral skade, kræver en model, der producerer lignende skader den kliniske tilstand og på en reproducerbar måde. Bilateral carotis tillukning af blodkar med hypotension (2VOH) er en model, der producerer reversibel forhjerneiskæmi, efterligne cerebrale begivenheder, der kan opstå under hjertestop og genoplivning. Vi beskriver en model modificeret fra Smith et al. (1984) 2, Som første gang præsenteret i sin nuværende form i Sanderson et al. (2008) 3, der producerer reproducerbar skade selektivt sårbare områder af hjernen 3-6. Pålideligheden af denne model er dikteret af præcis styring af systemiske blodtryk under anvendt hypotension, varigheden af iskæmi tæt temperaturkontrol, en specifik anæstesi regime, og omhyggelig postoperativ pleje. 8 minutter iskæmiske skade producerer celledød af CA1 hippocampale neuroner, der skrider i løbet af 6 til 24 timer af reperfusion, mens mindre sårbare hjerneregioner skånet. Denne progressiv celledød nemt kvantificeres efter 7-14 dage reperfusion, som et næsten komplet tab af CA1 neuroner er tydeligt på dette tidspunkt.
Ud over denne hjerneskade model præsenterer vi en metode til CA1 skade kvantificering hjælp af en simpel, men grundig, metodologi. Vigtigere, kan kvantificering opnås ved anvendelse af en simpel kameramonteret mikroskop, enda fri ImageJ (NIH) software-plugin, der ikke er behov for omkostningseffektive uoverkommelige stereologi softwareprogrammer og et motoriseret mikroskopisk scene for skadesvurdering.
Hjerneskade som følge af hjertestop og slagtilfælde er en førende årsag til død og langvarig invaliditet. Mens genoplivningsudstyr til ofre for hjertestop lykkes at genoprette spontan cirkulation i omkring 70.000 patienter om året i USA 7,8 mindst 60% af disse patienter efterfølgende dør på hospitalet som følge af en omfattende hjerneskade og kun 3-10% af genoplivet patienterne kan genoptage deres tidligere livsstil 9,10. Det er klart, at forstå de mekanismer, der fører til hjerneskade efter global hjerneiskæmi og designe terapeutiske indgreb for at minimere neurologiske traumer er af afgørende betydning.
Hjerneiskæmi kan modelleres udnytte flere metoder. Mest almindeligt er hjerneiskæmi produceret i gnaver ved okkludere et større blodkar i hjernen, den midterste cerebrale arterie, hvilket frembringer en fokal iskæmisk slagtilfælde 11,12. Mens klinisk vigtig,fokal hjerneiskæmi er ikke en præcis metode til at studere hjerneskade fremstillet ved hjertestop / genoplivning. At modellere denne kliniske paradigme hele hjernen skal gøres iskæmisk efterfulgt af genindførelse af blodgennemstrømningen. Til nøje at efterligne denne kliniske præsentation, efterforskere eksperimentelt fremkalde hjertestop efterfulgt af genoplivning med hjertemassage og defibrillering 13,14. Denne model er klinisk relevant, kan dog uforudsigelige genoplivning tider øger variabilitet og kan gøre dataanalyse vanskeligt at fortolke. Derudover er denne model forbundet med en høj dødelighed, hvilket yderligere øger dyrenummer nødvendigt at teste en hypotese. Undersøgelse af cerebral reaktion på global iskæmi og / eller reperfusion i en mere reproducerbar, sammenhængende og levedygtige fornærmelse kan foretrækkes.
Global iskæmi kan induceres i hjernen og samtidig bevare nogle blodgennemstrømningen systemisk. Dette reducerer dødelighed, samtidig med at investigation af mekanismerne i vævsskade i hjernen 2.. At producere globale hjerneiskæmi, er det nødvendigt at afbryde eller i høj grad begrænse strømning i alle fire blodkar, som forsyner hjernen, de interne halspulsårer og vertebrale arterier. Disse skibe forsyne hjernen med blod flow gennem en vaskulær struktur kaldet Circle of Willis, som udgør en anastomotisk løkke. Denne vaskulære arkitektur tillader hjernen at fastholde perfusion i tilfælde af proximale vaskulær okklusion. Derfor skal til at inducere fuldstændig iskæmi af hjernen blodgennemstrømning gennem alle bidragende fartøjer forekomme. Halspulsåren okklusion kan opnås ved hjælp af en minimalt invasiv ventrale hals cut-ned og anvendelse af aneurisme klip for en ønsket periode. Afbrydelse af blodgennemstrømningen via vertebrale arterier kan være vanskelig, da de er incased i tværgående huller af rygsøjlen. Efterforskere har behandlet dette ved at electrocauterizing vertebrale arterier 24-48 hr før carotisokklusion og hjerneiskæmi (4VO model) 15. I modsætning til denne fremgangsmåde, udviklede Smith et al. En fremgangsmåde til induktion af globale hjerneiskæmi ved at reducere betyde arterielt blodtryk (MAP) systemisk til 40 mmHg at reducere perfusion gennem de vertebrale arterier til et punkt, hvor blodgennemstrømningen er tabt eller reduceres kraftigt 2 . Når kombineret med carotis okklusion, denne metode giver iskæmi hele forhjernen, hvilket resulterer i et mønster af hjerneskade, der nøje efterligner hjertestop overlevende. I en yderligere forfining af denne metode kræver den model, vi præsenterer her tight MAP regulering på 30 mmHg ± 1mHg under hele 8 min af iskæmi. Vi fandt dette ændring forbedrer reproducerbarheden af hjerneskade induceret af denne model og samtidig bevare den lave dødelighed af den oprindelige teknik designet af Smith et al.
Den præcise fænotype celledød og samlede omfang af vævsskader forårsaget afden model, der præsenteres her er direkte afhængige af iskæmisk varighed 16. Efter 8 min iskæmi, udviser CA1 neuroner forsinket celledød, hvilket antyder, at der er en tidsmæssig vindue til terapeutisk intervention i reperfusionsfasen 15,17. Ved starten af reperfusion hurtigt neuroner genvinde funktion og ikke umiddelbart celledød er påviseligt 18.. Men dette fornærmelse forårsager induktion af celledød kaskader (apoptose), der kulminerer med frigivelsen af apoptogenic proteiner fra mitokondrier, herunder cytochrom c, mellem 4-6 hr reperfusion 3,19. Mellem 6 og 24 timers reperfusion, har neuroner i CA1 hippocampus forpligtet til celle død, og den apoptotiske celledød program gennemføres 19.. Det skal bemærkes, at celledød fænotype ansvarlig for iskæmisk skade er yderst kontroversiel. Tidlige undersøgelser har antydet nekrose er den primære celledød fænotype 20,21, mens andre andre rapporterer apoptOSIS som den vigtigste mekanisme 22,23. I alt tyder aktuelle beviser for, at cellerne dør af et spektrum af celledød fænotyper spænder fra klassisk apoptose til nekrose. Den specifikke form for celledød er afhængig af mange faktorer, med graden af bidragene fra hver fænotype afhængigt af sværhedsgraden af den fornærmelse, blandt andre faktorer 24,25. Ved 24 timers reperfusion, besidder døende celler pyknotiske kerner, kondenseret cytosol med klare beviser for aggregerede cellulære indhold og tab af funktionel mitokondrie morfologi. Døde celler er yderligere opdelt, opslugt af immunceller såsom makrofager og / eller mikroglia og slettes fra CA1 hippocampus region. Ved 4-7 dage reperfusion er døde celler fjernes, og alle, der er tilbage er inflammatoriske celler og aktiverede gliaceller 17,26. Derfor 7 dages reperfusion repræsenterer en optimal tid, hvor CA1 hippocampus neuronal død kan kvantificeres ved hjælp af enkle, uspecifikke celle pletterinklusive cresylviolet eller hemotoxylin-eosin og tælles baseret på morfologiske inklusionskriterier. Celler forbliver på dette sene reperfusion interval kan regnes som overlevende celler, hvilket giver et indeks for hjerneskade.
Hvis denne model er at blive udnyttet til at teste terapeutiske indgreb, foreslås det, at den eksperimentelle design følge TRAPPE kriterier (Stroke Terapi Academic Industri Roundtable) 27. Disse retningslinjer bør følges ved udformning og gennemførelse af en undersøgelse, der dog ikke behandles her.
Den her beskrevne model giver en iskæmisk fornærmelse til hjernen, der kan opstå som følge af hjertestop og genoplivning, giver en skade svarende til den, der findes hos mennesker. Denne fremgangsmåde til fremstilling af den globale hjerneiskæmi er en af flere protokoller. Vi bruger denne protokol fremmest for sin forholdsvis lav dødelighed, hurtig genopretning og reproducerbare resultater. Den hjertestop / genoplivning model er velsagtens den mest klinisk relevant model, men teknisk set den mest vanskelige…
The authors have nothing to disclose.
Material Name | |||
5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
1 ml syringe | BD | 309659 | |
10 ml syringe | BD | 309604 | |
60 ml syringe | BD | 309653 | |
Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
.9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
Drug Name | |||
AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
Chemical Name | |||
Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Software | |||
ImageJ | NIH |