ספיגה של 2 כלי השיט / תת לחץ דם: מודל עכברוש של איסכמיה המוח הגלובלית

Summary

חסימת עורק תרדמה דו צדדית בשילוב עם ירידה בלחץ דם מערכתי מייצרת איסכמיה המוחית העולמית בחולדה, וכתוצאה מכך לנזק ליפוקמפוס בחומרה לשחזור. נושאי בעלי החיים הם לקויים עם דפוסים צפויים של נזק מוחי, הם להתאושש expediently, ושיעורי תמותה הם נמוכים יחסית.

Abstract

דום לב ואחריו החייאה לעתים קרובות תוצאות נזק מוחי שנגרם על ידי איסכמיה דרמטי וreperfusion הבאה של המוח. איסכמיה המוחית העולמית מייצרת נזק לאזורים ספציפיים במוח המוצגים להיות רגיש מאוד לאיסכמיה ^1. יש נוירונים בהיפוקמפוס רגישות גבוהה יותר לעלבונות איסכמי בהשוואה לאוכלוסיות תאים אחרים, ובמיוחד באזור CA1 של ההיפוקמפוס הוא פגיע במיוחד לאיסכמיה / reperfusion ^2.

העיצוב של התערבויות טיפוליות, או לימוד של מנגנונים המעורבים בנזק מוחי, מחייב מודל שמייצר נזק דומה למצב הקליני ובאופן שחזור. חסימת כלי דם עורק תרדמה דו צדדי עם ירידה בלחץ דם (2VOH) הוא מודל שמייצר מוח קדמי איסכמיה הפיכה, לחקות את האירועים המוחיים שיכול להתרחש בעת מעצר ובהחייאת לב. אנו מתארים מודל שונה מסמית et al. (1984) ², כפי שהוצג לראשונה במתכונתו הנוכחית בשנת סנדרסון et al. (2008) ^3, אשר מייצר פגיעה לשחזור לאזורים במוח פגיע סלקטיבי ^3-6. האמינות של הדגם הזה מוכתבת על ידי שליטה מדויקת של לחץ דם תת לחץ דם מערכתי במהלך מוחל, את משך הזמן של איסכמיה, בקרת טמפרטורה קרובה, משטר הרדמה ספציפי, וטיפול שלאחר הניתוח חרוץ. עלבון איסכמי 8 דקות מייצר מוות של תאי CA1 של נוירונים בהיפוקמפוס שמתקדם לאורך המסלול של 6 עד 24 שעות של reperfusion, ואילו אזורים במוח פחות פגיעים הם חסכו. מוות של תאים מתקדמים זה הוא לכמת בקלות לאחר 7-14 ימים של reperfusion, כאובדן מוחלט כמעט של CA1 עצב ניכר בשלב זה.

בנוסף למודל פגיעה מוחית זו, אנו מציגים שיטה לכימות נזק CA1 באמצעות פשוטה, אך יסודית, מתודולוגיה. חשוב מכך, ניתן להשיג כימות באמצעות מיקרוסקופ מצלמה רכוב פשוט,(NIH) תוסף דה החופשי ImageJ תוכנה, מייתר את הצורך בתוכנות Stereology עלות אוסרני ושלב מיקרוסקופי ממונע להערכת נזק.

Introduction

נזק מוחי כתוצאה ממעצר ושבץ לב הוא גורם מוביל של מוות ונכות לטווח ארוך. בעוד החייאה לנפגעי דום הלב מצליחה להשיב את הזרימה ספונטנית בכ -70,000 מטופלים בשנה בארה"ב ^7,8 לפחות 60% מהחולים הללו לאחר מכן נפטרו בבית החולים כתוצאה מניזק מוחי נרחב ורק 3-10% החייאה של חולים יכול לחזור לאורח החיים הקודמים שלהם ^9,10. ברור, הבנת המנגנונים שיובילו לנזק מוחי בעקבות איסכמיה המוחית העולמית ותכנון התערבויות טיפוליות כדי למזער את טראומת נוירולוגית היא בעל חשיבות קריטית.

יכולה להיות מודל איסכמיה ניצול שיטות מרובות. ברוב המקרים, איסכמיה מיוצרת במכרסם ידי occluding כלי דם גדול במוח, עורק המוח האמצעי, ובכך לייצר שבץ איסכמי ^11,12 מוקד. בעוד חשיבות קלינית,איסכמיה מוקד היא לא שיטה מדויקת ללמוד נזק מוחי המיוצר על ידי מעצר / החייאת לב. למודל הפרדיגמה קלינית זו את המוח כולו חייבת להתבצע איסכמי ואחרי חידוש של זרימת דם. כדי לחקות את המצגת קלינית זה מקרוב, חוקרים בניסוי לגרום דום לב ואחריו החייאה עם החייאה ודפיברילציה ^13,14. מודל זה הוא רלוונטי מבחינה קלינית, פעמים החייאה אך בלתי צפויות יכולות להגדיל את השונות ועלולות להפוך את ניתוח הנתונים קשה לפרש. בנוסף, מודל זה קשור לשיעור תמותה גבוה, נוסף להגדיל את מספר בעלי החיים דרוש כדי לבדוק את השערה. חוקר את תגובת המוח לאיסכמיה העולמית ו / או בreperfusion עלבון יותר לשחזור, עולה בקנה אחד, ולשרוד עשוי להיות מועדף.

איסכמיה גלובלית יכולה להיגרם במוח תוך שמירה על כמה זרימת דם מערכתית. זה מפחית את התמותה, ובמקביל לאפשר investigation של המנגנונים של נזק לרקמות במוח ^2. כדי לייצר איסכמיה המוחית הגלובלית, יש צורך להפסיק או להגביל באופן משמעותי את הזרימה בכל ארבעת כלי המספקים את המוח, עורקי הראש הפנימיים ועורקי חוליות. כלים אלה מספקים למוח את זרימת דם דרך מבנה כלי דם הנקרא מעגל ויליס, המהווה לולאת anastomotic. ארכיטקטורה זו מאפשרת לכלי דם במוח כדי לשמור זלוף במקרה של חסימת כלי דם הפרוקסימלי. לכן, כדי לגרום לאיסכמיה של המוח, זרימת הדם מלאה בכל כלי התורמים חייבת להתרחש. ניתן להשיג זאת באמצעות חסימת העורק הראשי בצוואר פולשנית הגחון חתך למטה ויישום של קליפים פרצה לתקופה רצויה. הפרעה בזרימת דם דרך העורקים בחוליות יכולה להיות קשה, כפי שהם כלוא בforamina הרוחבי של עמוד השדרה. חוקרים התייחסו לזה על ידי electrocauterizing העורקים בחוליות 24-48 שעות לפני התרדמההחסימה ואיסכמיה (4VO דגם) ^15. בניגוד לגישה זו, סמית ואח'. פיתחה שיטה של גרימת איסכמיה מוח הגלובלית על ידי צמצום מתכוון לחץ דם העורקי (MAP) מערכתית עד 40 מ"מ כספית כדי להפחית זלוף דרך העורקים בחוליות לנקודה שבה זרימת דם הולכת לאיבוד או מופחתת במידה ניכרת ² . כאשר בשילוב עם חסימת עורק תרדמה, שיטה זו מייצרת איסכמיה לאורך המוח הקדמי, וכתוצאה מדפוס של נזק מוחי שמחק באופן הדוק זה של ניצולי דום לב. בחידוד נוסף של שיטה זו, המודל שאנו מציגים כאן דורש רגולציה הדוקה מפה ב30 מ"מ כספית ± 1mHg במהלך דקות 8 השלם של איסכמיה. מצאנו שינוי זה משפר את שחזור של נזק מוחי הנגרם על ידי מודל זה תוך שמירה על שיעור התמותה הנמוך של הטכניקה המקורית שתוכננה על ידי סמית ואח'.

הפנוטיפ המדויק של מוות של תאים והיקף כולל של נזק לרקמות שנגרם על ידיהמודל המוצג כאן תלוי באופן ישיר משך ¹⁶ איסכמי. בעקבות 8 דקות של איסכמיה, CA1 נוירונים התערוכה עכבו מוות של תאים, מה שמרמז שיש חלון זמן להתערבות טיפולית בשלב reperfusion ^15,17. בתחילת reperfusion, הנוירונים להחזיר במהירות תפקוד ולא מוות של תאים לזיהוי מיידי הוא ^18. עם זאת עלבון זה גורם לאינדוקציה של מפלי מוות של תאים (אפופטוזיס) המגיע לשיאה בשחרורו של חלבוני apoptogenic ממיטוכונדריה, כולל ציטוכרום C, בין 4-6 שעות של reperfusion ^3,19. בין 6 ל 24 שעות של reperfusion, נוירונים ביפוקמפוס CA1 התחייבו מותו של תא, ואת תכנית המוות של תאי אפופטוטיים מבוצעת ^19. יש לציין שהתא פנוטיפ המוות האחראי לפגיעה איסכמית הוא שנוי במחלוקת. מחקרים מוקדמים הראו נמק הוא הפנוטיפ המוות של תאים הראשוני ^20,21, בעוד שאחרים ידווחו אחרים apoptOSIS כמנגנון העיקרי ^22,23. בסך הכל, ראיות נוכחי מצביעות על כך שהתאים מתים מספקטרום של פנוטיפים מוות של תאים הנעים בין קלאסי לאפופטוזיס נמק. המצב הספציפי של מוות של תאים תלוי בגורמים רבים, במידת התרומה של כל פנוטיפ בהתאם לחומרה של העלבון, בין גורמים אחרים ^24,25. ב -24 שעות של reperfusion, תאים מתים בעלי גרעיני pyknotic, cytosol המרוכז עם ראיות ברורות של תוכן סלולרי מצטבר, והפסד של המיטוכונדריה מורפולוגיה פונקציונלית. תאים מתים שבורים עוד יותר למטה, נבלעו על ידי תאי מערכת חיסון כגון מקרופאגים ו / או מיקרוגלים, ופינו מאזור CA1 בהיפוקמפוס. על ידי 4-7 ימים של reperfusion, תאים מתים יוסרו, וכל מה שנשאר הם תאים דלקתיים והופעלו תאי גלייה ^17,26. לכן, 7 ימים של reperfusion מייצגים זמן אופטימלי שבו ניתן לכמת CA1 מוות עצבי בהיפוקמפוס באמצעות כתמים סלולריים פשוטים, שאינם ספציפיים בcluding סגול cresyl או hemotoxylin-eosin וספר מבוססים על קריטריוני הכללה המורפולוגיים. תאים שנותרו במרווח reperfusion מאוחר זה יכול להיחשב כתאים ששרדו, ובכך לספק מדד של נזק מוחי.

אם המודל הזה הוא להיות מנוצל כדי לבדוק התערבויות טיפוליות, הוא הציע שעיצוב הניסיון לעקוב אחר קריטריוני מדרגות (תעשייה אקדמית טיפול שבץ שולחן עגול) ^27. הנחיות אלה צריכה להיות מלווה בעת תכנון וביצוע מחקר, אולם הם לא נדונו כאן.

Protocol

1. הכנה כל הניסויים בבעלי החיים חייבים להתאים להנחיות מוסדיות ולקבל אישור על ידי ועדה בהתאמה טיפול בבעלי חיים קודם לחניכה. כל הנהלים המוצגים כאן אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי ויין סטייט ומשתמשים הוועדה ופעל בהתאם להנחיות …

Representative Results

מודל 2VOH של איסכמיה / reperfusion הגלובלית גורם למוות עצבי באזור CA1 של ההיפוקמפוס. איור 2 מייצג את פגיעה המיוצרת על ידי 8 דקות של איסכמיה המוחית העולמית, מעובד 14 ימים לאחר reperfusion. איורים 2 א ו -2 להשוות hippocampi מאחיזת העיניים ו מוחות פוסט איסכמי, מוכתמים עם סגול cre…

Discussion

המודל שתואר כאן מייצר עלבון איסכמי למוח, אשר יכול להתרחש כתוצאה ממעצרו וההחייאה, מתן פציעה דומה לזו שנמצאה בבני אדם. שיטה זו להפקת איסכמיה המוח הגלובלית היא אחד מפרוטוקולים מרובים. אנו משתמשים בפרוטוקול זה ובראשונה לשיעורה הנמוך comparably התמותה, התאוששות מהירה, ותוצאות…

Materials

			Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
			Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
			Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
			Software
ImageJ	NIH