2-окклюзии сосудов / Гипотония: крысиной модели глобальной ишемии мозга
Summary
Двусторонние окклюзии сонной сочетании с системной гипотензии производит глобальной ишемии мозга у крыс приводит к повреждению гиппокампа с воспроизводимыми тяжести. Животное субъектов обесценились с предсказуемый характер повреждения головного мозга, они выздоравливают целесообразно, и смертность сравнительно низки.
Abstract
Остановка сердца последующей реанимации часто приводит к резкому повреждение головного мозга, вызванных ишемией и последующей реперфузии головного мозга. Глобальной ишемии мозга производит повреждение определенных областях мозга показано, что весьма чувствительными к ишемии 1. Нейронов гиппокампа имеют более высокую чувствительность к ишемического инсульта по сравнению с другими популяции клеток, и, в частности, области СА1 гиппокампа особенно подвержена ишемии / реперфузии 2.
Конструкция терапевтическое вмешательство или изучение механизмов, участвующих в повреждения головного мозга, требуется модель, которая производит повреждение похожа на клиническое состояние и воспроизводимым образом. Двусторонние окклюзии сонной судно с гипотонией (2VOH) представляет собой модель, которая формирует обратимой ишемии переднего мозга, подражая головного события, которые могут произойти во время остановки сердца и реанимации. Мы описали модель редактировался Смит и др.. (1984) 2, А впервые представлена в его нынешнем виде в Sanderson и соавт. (2008) 3, который производит воспроизводимых травмы выборочно уязвимых регионах мозга 3-6. Надежность этой модели продиктован точным контролем системного артериального давления при гипотонии применяются, длительность ишемии, тщательный контроль температуры, специальную схему анестезии, и прилежные послеоперационного ухода. 8 минут ишемического инсульта производит гибель клеток СА1 нейронов гиппокампа, который прогрессирует в течение от 6 до 24 часов реперфузии, в то время как менее уязвима областей мозга избавлены. Эта прогрессивная гибели клеток легко количественно 7-14 дней после реперфузии, как почти полная потеря нейронов CA1 очевидно, в это время.
В дополнение к этой модели мозговой травмы, мы представляем метод для количественного CA1 повреждения с помощью простой, но тщательно, методология. Важно отметить, что количественное может быть достигнуто с помощью простого монтажа камеры микроскопа,Да Фри ImageJ (NIH) программного обеспечения плагин, что исключает необходимость в непомерно программ стереологии программного обеспечения и моторизованных микроскопические стадии оценки ущерба.
Introduction
Повреждения головного мозга, как следствие, остановки сердца и инсульт является одной из ведущих причин смерти и длительной инвалидности. В то время сердечно-легочной реанимации для жертв остановки сердца успеха в деле восстановления спонтанного кровообращения примерно в 70 000 пациентов в год в США 7,8 по меньшей мере 60% этих больных впоследствии умирают в больнице в результате обширного повреждения головного мозга, и только 3-10% из реанимации пациенты могут возобновить свои бывшие 9,10 образа жизни. Очевидно, что понимание механизмов, которые приводят к повреждению мозга после глобальной ишемии мозга и проектирования терапевтического вмешательства, чтобы минимизировать неврологические травмы имеет решающее значение.
Ишемии мозга может быть смоделировано использованием различных методов. Чаще всего, ишемии головного мозга производится в грызунах по окклюзии главный кровеносный сосуд в мозге, средней мозговой артерии, производя таким образом координационного ишемического инсульта 11,12. В то время как клинически значимые,фокальной ишемии мозга не является точным методом изучения мозга ущерб в результате остановки сердца / реанимации. Для моделирования этой клинической парадигмы весь мозг должен быть сделан ишемический последующей реинтродукции кровотока. Чтобы точно имитировать эту клиническую картину, исследователи экспериментально вызвать остановку сердца последующей реанимации с СЛР и дефибрилляции 13,14. Эта модель является клинически значимым, однако непредсказуемое время реанимации может увеличить изменчивость и может сделать анализ данных трудно интерпретировать. Кроме того, эта модель связана с высокой смертностью, дальнейшее увеличение числа животных необходимо проверить гипотезу. Исследование головного ответ на глобальной ишемии и / или реперфузии в более воспроизводимым, последовательной и живучие оскорбление может быть предпочтительным.
Глобальной ишемии может быть индуцирован в головном мозге при сохранении некоторых кровоток системно. Это снижает смертность, позволяя при этом investigatioн механизмов повреждения тканей в головном мозге 2. Для получения глобальной ишемии мозга, необходимо прервать или значительно ограничить поток во всех четырех сосудов, которые снабжают мозг, внутренней сонной артерии и позвоночных артерий. Эти сосуды снабжают мозг с кровотоком через сосудистый структура, называемая Круг Уиллис, которая образует петлю анастомоза. Эта архитектура позволяет сосудистой головной мозг, чтобы сохранить перфузии в случае проксимальной окклюзии сосудов. Таким образом, чтобы вызвать полную ишемию головного мозга, кровоток через все сопутствующие сосуды должны произойти. Сонной артерии может быть достигнуто при использовании минимально инвазивной вентральной шеи урезанную и применение аневризмы клипы на желаемый срок. Нарушению кровотока по позвоночным артериям может быть трудно, так как они incased в поперечном отверстий отдела позвоночника. Исследователи решали эту проблему, electrocauterizing позвоночных артерий 24-48 ч до соннойокклюзии и ишемии мозга (4VO модели) 15. В противоположность этому подходу, Smith и соавт. Разработали способ индукции ишемии мозга за счет снижения среднего артериального давления (MAP) системно до 40 мм для уменьшения перфузии через позвоночные артерии до точки, где поток крови теряется или значительно снижается 2 . В сочетании с окклюзией сонных, этот метод вызывает ишемию всей переднего мозга, в результате чего модель повреждения головного мозга, которые близко имитирует сердечной выживших после остановки. С целью дальнейшего совершенствования этого метода, модели, представленной здесь требует жесткого регулирования MAP на 30 мм рт.ст. ± 1mHg в течение всего 8 мин ишемии. Мы нашли это изменение улучшает воспроизводимость мозга повреждений, вызванных этой модели, сохраняя при этом низкий уровень смертности оригинальной методики разработаны Смит и др..
Точный фенотип клеточной смерти и общую степень повреждения тканей вызванныхМодель, представленная здесь напрямую зависит от продолжительности ишемических 16. После 8 мин ишемии СА1 нейронов демонстрируют задерживается гибели клеток, что свидетельствует о наличии временного окна для терапевтического вмешательства во время фазы реперфузии 15,17. В начале реперфузии, нейроны быстро восстановить функцию и никакого непосредственного гибели клеток не определяется 18. Однако это оскорбление вызывает индукцию каскадов гибель клеток (апоптоз), которые завершаются выпуском апоптогенное белки из митохондрий, включая цитохром С, 4-6 ч реперфузии 3,19. Между 6 и 24 часа в сутки реперфузии нейронов CA1 гиппокампа обязались клетки кончину, и программа апоптоза гибель клеток, выполненном 19. Следует отметить, что гибель клеток ответственны за фенотип ишемическое повреждение является весьма спорным. Ранние исследования показали, некроз является основной фенотип гибели клеток 20,21, в то время как другие другие сообщают apoptОсис в качестве основного механизма 22,23. В общей сложности, имеющиеся данные позволяют предположить, что клетки умирают спектра гибели клеток фенотипы от классического апоптоза некроз. Конкретный режим гибели клеток зависит от многих факторов, причем степень вклада каждого фенотипа в зависимости от тяжести инсульт, среди других факторов, 24,25. К 24 ч реперфузии, умирающие клетки обладают пикнотических ядер, сгущенное цитозоле с четкими признаками агрегированных клеточного содержимого, и потеря функциональной морфологии митохондрий. Мертвые клетки разбиты, охвачен иммунных клеток, таких как макрофаги и / или микроглии и очищены от CA1 гиппокампа. На 4-7 дней реперфузии, мертвые клетки удаляются, а все, что остается являются воспалительными клетками и активированные глиальные клетки 17,26. Таким образом, 7 дней реперфузии представляет собой оптимальное время где СА1 гиппокампа гибель нейронов может быть определена количественно с помощью простых, неспецифический пятна ячейкиCresyl том числе фиолетовые или hemotoxylin-эозином и подсчитывали на основе морфологических критериев включения. Клеток, оставшихся в этот поздний интервал реперфузии может быть расценено как выживших клеток, тем самым обеспечивая индекс повреждения мозга.
Если эта модель должна быть использована для проверки терапевтических вмешательств, предполагается, что опытно-конструкторские следовать ЛЕСТНИЦЫ критериев (терапии инсульта Академический промышленности Круглого стола) 27. Эти принципы должны соблюдаться при планировании и проведении исследования, однако здесь не обсуждаются.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта модель описана здесь производит ишемического инсульта головного мозга, которые могут возникнуть в результате остановки сердца и реанимации, обеспечивая травмы подобный тем, которые имеются у людей. Этот способ получения глобальной ишемии мозга является одним из множества проток?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | |||
| 5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
| Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
| Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| 18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
| 23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
| 26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
| 18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
| .9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
| Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
| Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
| Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
| Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
| Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
| Drug Name | |||
| AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
| Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
| Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
| Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
| Chemical Name | |||
| Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH |
Riferimenti
- Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
- Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
- Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
- Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
- Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscienze. 169, 1307-1314 (2010).
- Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
- Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
- Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
- Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
- Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. , (2012).
- Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
- Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
- Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
- Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
- Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39 (1999).
- Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
- Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscienze. 35, 525-550 (1990).
- Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
- Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
- Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
- Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
- Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
- Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
- Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
- Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
- Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
- Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
- Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).
