Oclusión de la carótida bilateral junto con hipotensión sistémica produce isquemia cerebral global en la rata, lo que resulta en daños en el hipocampo con la gravedad reproducibles. Temas de animales se deterioran con patrones predecibles de daño cerebral, que se recuperan convenientemente, y las tasas de mortalidad son relativamente bajos.
El paro cardiaco seguido de reanimación a menudo resulta en daño cerebral causado por la isquemia dramática y la posterior reperfusión del cerebro. Isquemia cerebral global produce daños en regiones específicas del cerebro que han demostrado ser altamente sensibles a la isquemia 1. Las neuronas del hipocampo tienen mayor sensibilidad a los insultos isquémicos en comparación con otras poblaciones de células, y específicamente, la región CA1 del hipocampo es particularmente vulnerable a la isquemia / reperfusión 2.
El diseño de las intervenciones terapéuticas, o el estudio de los mecanismos implicados en el daño cerebral, requiere un modelo que produce un daño similar a la condición clínica y de una manera reproducible. Bilateral oclusión vascular carotídeo con hipotensión (2VOH) es un modelo que produce isquemia reversible cerebro anterior, emulando los eventos cerebrales que pueden ocurrir durante el paro cardiaco y la reanimación. Se describe un modelo modificado de Smith et al. (1984) 2, Tal como se presenta por primera vez en su forma actual en Sanderson et al. (2008) 3, que produce lesiones reproducible de forma selectiva las regiones vulnerables del cerebro 3-6. La fiabilidad de este modelo es dictada por un control preciso de la presión arterial sistémica durante la hipotensión aplicada, la duración de la isquemia, control de la temperatura cerca, un régimen de anestesia específica, y el cuidado post-operatorio diligente. Un insulto isquémico-8 minutos produce la muerte celular de neuronas CA1 del hipocampo que progresa en el transcurso de 6 a 24 h de la reperfusión, mientras que las regiones cerebrales menos vulnerables están a salvo. Esta muerte celular progresiva se cuantifica fácilmente después de 7-14 días de reperfusión, como una pérdida casi completa de las neuronas CA1 es evidente en este momento.
Además de este modelo de lesión cerebral, se presenta un método para CA1 daños cuantificación usando una simple, pero completa, metodología. Es importante destacar que, la cuantificación puede llevarse a cabo usando un microscopio simple cámara montada, unada libre ImageJ (NIH) de software plugin, obviando la necesidad de programas de software estereología costos prohibitivos y una etapa microscópica motorizado para la evaluación de daños.
El daño cerebral como consecuencia de un paro cardíaco y accidente cerebrovascular es la principal causa de muerte y discapacidad a largo plazo. Mientras que la reanimación cardiopulmonar a las víctimas de paro cardiaco éxito en la restauración de la circulación espontánea en unos 70.000 pacientes por año en los EE.UU. 7,8 al menos el 60% de estos pacientes posteriormente murió en el hospital a consecuencia de daño cerebral extenso y sólo el 3-10% de los pacientes reanimados puede reanudar sus antiguos estilos de vida 9,10. Evidentemente, la comprensión de los mecanismos que conducen a un daño cerebral después de isquemia cerebral global y el diseño de las intervenciones terapéuticas para minimizar el trauma neurológico es de importancia crítica.
Isquemia cerebral puede ser modelado utilizando varios métodos. Más comúnmente, la isquemia cerebral se produce en el roedor mediante la oclusión de un vaso sanguíneo importante en el cerebro, la arteria cerebral media, produciendo de este modo un accidente cerebrovascular isquémico focal 11,12. Aunque clínicamente importante,isquemia cerebral focal no es un método preciso para estudiar el daño cerebral producido por paro cardiaco / reanimación. Para modelar este paradigma clínica todo el cerebro se debe hacer isquémica seguida de la reintroducción del flujo de sangre. Para imitar de cerca esta presentación clínica, los investigadores inducen experimentalmente paro cardíaco seguido de reanimación con la RCP y desfibrilación 13,14. Este modelo es clínicamente relevante, los tiempos de reanimación sin embargo impredecibles pueden aumentar la variabilidad y puede hacer que el análisis de datos difíciles de interpretar. Adicionalmente, este modelo se asocia con una alta tasa de mortalidad, aumentando aún más el número de animales necesarios para probar una hipótesis. La investigación de la respuesta cerebral a la isquemia global y / o reperfusión en un insulto más reproducible, consistente y de supervivencia puede ser preferido.
Isquemia global puede ser inducida en el cerebro preservando al mismo tiempo el flujo de sangre sistémica. Esto reduce la mortalidad, al tiempo que permite investigation de los mecanismos de daño tisular en el cerebro 2. Para producir isquemia cerebral global, es necesario interrumpir o limitar en gran medida el flujo en todos los cuatro vasos que irrigan el cerebro, las arterias carótidas internas y las arterias vertebrales. Estos vasos suministran el cerebro con el flujo de sangre a través de una estructura vascular llamado el Círculo de Willis, que forma un bucle anastomosis. Esta arquitectura vascular permite que el cerebro para retener la perfusión en el caso de la oclusión vascular proximal. Por lo tanto, para inducir isquemia completa del cerebro, el flujo de sangre a través de todos los buques contributivas debe ocurrir. Oclusión de la arteria carótida se puede lograr usando un cuello ventral mínimamente invasiva corte hacia abajo y la aplicación de los clips de aneurisma durante un período deseado. La interrupción del flujo de sangre a través de las arterias vertebrales puede ser difícil, ya que es incluida de los forámenes transversal de la columna vertebral. Los investigadores han abordado este por electrocauterizing las arterias vertebrales 24-48 horas antes de la carótidala oclusión y la isquemia cerebral (4VO modelo) 15. En contraste con este enfoque, Smith et al. Desarrolló un método de inducción de isquemia cerebral global mediante la reducción de la presión arterial media (MAP) sistémicamente a 40 mm de Hg para reducir la perfusión a través de las arterias vertebrales a un punto en el que el flujo sanguíneo se pierde o se reduce en gran medida 2 . Cuando se combina con oclusión de la carótida, este método produce isquemia en todo el cerebro anterior, lo que resulta en un patrón de daño cerebral que imita la de los supervivientes de paro cardiaco. En un refinamiento adicional de este método, el modelo que aquí presentamos requiere una regulación MAPA ajustado a 30 mm de Hg ± 1mHg durante todo el 8 min de isquemia. Encontramos esta alteración mejora la reproducibilidad de daño cerebral inducido por este modelo, mientras que la preservación de la baja tasa de mortalidad de la técnica original diseñada por Smith et al.
El fenotipo preciso de la muerte celular y la extensión global de la lesión tisular causada porel modelo que aquí se presenta es directamente dependiente de la duración isquémica 16. Después de 8 minutos de isquemia, las neuronas CA1 exhiben la muerte celular retardada, lo que sugiere que hay una ventana temporal para la intervención terapéutica durante la fase de reperfusión 15,17. En el inicio de la reperfusión, las neuronas recuperar rápidamente la función y no la muerte celular inmediata es detectable 18. Sin embargo hace que este insulto inducción de la cascada de muerte celular (apoptosis) que culminan en la liberación de proteínas apoptogénicos de las mitocondrias, como citocromo c, entre las 4-6 horas de la reperfusión 3,19. Entre 6 y 24 horas de la reperfusión, las neuronas del hipocampo CA1 se han comprometido a muerte celular, y el programa de muerte celular por apoptosis se ejecuta 19. Cabe señalar que el fenotipo muerte celular responsable de la lesión isquémica es muy controvertida. Estudios anteriores han sugerido que la necrosis es el principal fenotipo muerte celular 20,21, mientras que otros que otros informan apoptosis como el principal mecanismo de 22,23. En total, la evidencia actual sugiere que las células mueren a causa de un espectro de fenotipos de muerte celular que van desde la apoptosis clásica a la necrosis. El modo específico de la muerte celular es dependiente de muchos factores, con el grado de contribución de cada fenotipo dependiendo de la gravedad de la lesión, entre otros factores 24,25. Por 24 h de la reperfusión, las células que mueren poseen núcleos picnóticos, citosol condensada con evidencia clara de los contenidos celulares agregados, y la pérdida de la morfología mitocondrial funcional. Las células muertas se desglosan, engullidas por las células inmunes como los macrófagos y / o microglia y borran de la región CA1 del hipocampo. Por 4-7 días de reperfusión, se eliminan las células muertas, y todo lo que queda son las células inflamatorias y las células gliales activadas 17,26. Por lo tanto, los 7 días de reperfusión representa un momento óptimo en CA1 del hipocampo muerte neuronal se puede cuantificar usando, las manchas de células no específicas simplesincluyendo violeta de cresilo o hematoxilina-eosina y se cuentan en base a criterios de inclusión morfológicas. Las células que quedan en este intervalo de reperfusión tardía se pueden contar como células supervivientes, lo que proporciona un índice de daño cerebral.
Si este modelo es para ser utilizado para probar las intervenciones terapéuticas, se sugiere que el diseño experimental sigue criterios ESCALERAS (Terapia Carrera Industria Académico mesa redonda) 27. Estas pautas se deben seguir en el diseño y la realización de un estudio, sin embargo, no se discuten aquí.
El modelo descrito aquí produce un insulto isquémico al cerebro que puede ocurrir como resultado de un paro cardiaco y la reanimación, proporcionando una lesión similar a la encontrada en los seres humanos. Este método para la producción de isquemia cerebral global es uno de los múltiples protocolos. Utilizamos este protocolo más importante de su tasa comparativamente baja mortalidad, recuperación rápida, con resultados reproducibles. El modelo de detención / resucitación cardiaca es posiblemente el modelo m…
The authors have nothing to disclose.
Material Name | |||
5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
1 ml syringe | BD | 309659 | |
10 ml syringe | BD | 309604 | |
60 ml syringe | BD | 309653 | |
Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
.9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
Drug Name | |||
AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
Chemical Name | |||
Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Software | |||
ImageJ | NIH |