Summary

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Published: April 03, 2013
doi:

Summary

Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que implica<em> Ex utero</em> Electroporación, la disección y la cultura de la totalidad de los hemisferios cerebrales del ratón embrionario. La preparación facilita los estudios farmacológicos y ensayos de la función de genes durante el desarrollo cortical temprano.

Abstract

Desarrollo cortical implica interacciones complejas entre las neuronas y no neuronales elementos incluyendo células precursoras, los vasos sanguíneos, las meninges y la matriz extracelular asociada. Debido a que proporcionan un entorno adecuado organotípico, los explantes corticales rebanada se utilizan a menudo para investigar las interacciones que controlan la diferenciación neuronal y el desarrollo. Aunque es beneficioso, el modelo de explante rebanada puede sufrir de inconvenientes que incluyen la laminación celular aberrante y la migración. Aquí mostramos un todo sistema cerebral explante hemisferio para estudios de desarrollo temprano cortical que es más fácil de preparar que las rebanadas corticales y programas de migración coherente organotípico y laminación. En este modelo de sistema, laminación principios y patrones de migración continuará normalmente durante un período de dos días in vitro, incluido el período de dividir la presiembra, durante el cual la capa cortical prospectivo seis formas. Desarrollamos entonces un ex electroporación in utero (EUEP)enfoque que logra el éxito ~ 80% en la selección de buenas prácticas agrarias expresión en las neuronas en desarrollo en la corteza medial dorsal.

El modelo de explante hemisferio entero hace que el desarrollo temprano cortical accesible para la electroporación, la intervención farmacológica y enfoques en vivo de imágenes. Este método evita la cirugía supervivencia requeridos en el útero de la electroporación (IUEP) enfoques al tiempo que mejora tanto la transfección y la consistencia de área de focalización. Este método facilitará los estudios experimentales de la proliferación neuronal migración y diferenciación.

Introduction

Las formas de la corteza cerebral de mamíferos a través de la proliferación concertada migración y diferenciación de las neuronas generadas sucesivamente. Cada neurona nace en la zona ventricular (VZ) y migra desde el VZ en la zona intermedia (IZ), formando la placa cortical (CP) 1. A medida que pasan a través de diferentes dominios corticales, las neuronas que migran mostrar múltiples modos de migración 2,3 que dependen del ambiente extracelular y otros elementos celulares (por ejemplo, la glía radial) dentro del tejido en desarrollo. Las neuronas corticales entonces detener la migración en la parte superior de la placa de conformación cortical en los procesos coincidentes de detención migración neuronal y 4 dendritogenesis.

Desarrollo cortical se inicia entre días embrionarias 11-13 (E11-13) 5 mediante el establecimiento de la capa plexiforme primordial 6 o la presiembra (PP), una capa de neuronas pioneras que recubre el VZ. FuturoCapa 6 neuronas corticales (es decir, las neuronas corticales primero nacido en el VZ) y luego orientar su Somata en un patrón estereotipado y se unen en una capa distinta en el PP 7. Estos eventos dividir la presiembra en un superficial marginal (futura capa cortical 1) y una zona profunda, el segundo compuesto de células subplaca (capa cortical transitoria 7). Este proceso, denominado fraccionamiento presiembra, es un acontecimiento fundamental en el crecimiento futuro de la corteza cerebral 8.

Muchas mutaciones genéticas se han identificado que interrumpir diversos aspectos del desarrollo cortical 9. Desarrollo cortical también pueden sufrir efectos negativos por la exposición a las toxinas ingeridas como la cocaína y el alcohol 10 11. Debido a las malformaciones corticales que surgen durante el desarrollo probablemente contribuyen a los trastornos neurológicos (por ejemplo, el autismo, la esquizofrenia), las investigaciones empíricas de las perturbaciones del desarrollo cortical son inherentesmente importante. Por tanto, es de gran importancia para establecer enfoques para estudiar el desarrollo cortical que permiten ensayos rápidos de los efectos genéticos o toxina, pero que también preservar las posibles interacciones entre las neuronas diferenciadoras, otros tipos de células y la matriz extracelular (ECM) durante este período temprano del desarrollo del cerebro 12 .

Explantes rebanada 13 han proporcionado un sistema y han sido ampliamente utilizados para el desarrollo del ensayo neurona cortical 14-16. Sin embargo, los ensayos de rebanada puede adolecen del inconveniente de que la migración neuronal y la laminación puede ser anormal 17 posiblemente debido al daño a las células de las meninges que rodean el cerebro en desarrollo y el anclaje radial glial andamiaje. Como las fibras gliales radiales son un importante sustrato para la migración cortical neuronal 18 disrupción de la membrana basal por corte local puede alterar la arquitectura glial radial y causar la migración cortical alterada. Además el sliced superficies de explantes proporciona una región de células muertas que pueden alterar la composición normal de la ECM en estas áreas.

Los enfoques más recientes se han centrado su análisis en células localizadas profundamente en el sector que están rodeados de apropiados tipos de células sanas y ECM. Sin embargo, en algunos casos, estos nuevos enfoques pueden exigir que el original rebanada gruesa cultivadas ser crio-seccionado o seccionado en parafina después de la fijación de manera que el interior relativamente normal de la rebanada está disponible para el análisis 19-21. Tanto el vibratome original de seccionamiento para preparar las rodajas en vivo para el cultivo, así como la posterior de las rebanadas cryosectioning fijos para el análisis requieren un cuidado y esfuerzo para estos ensayos a trabajar.

Proporcionar un enfoque simple y complementaria para los estudios del desarrollo cortical temprano, hemos modificado una rebanada enfoques existentes 13 para facilitar los estudios del desarrollo cortical temprano. Hemos desarrollado un whhemisferio ole explante similar a un modelo existente E14 hemisferio que participan cultivos con agitación a 65 revoluciones por minuto y el crecimiento organotípico permitido para 16-18 horas 22,23 modelo. En nuestro enfoque, los explantes enteros hemisferio se colocan en la membrana semipermeable 13 con en una atmósfera de oxígeno alta cultura 21,24 para extender el crecimiento cortical organotípicos durante 48 horas. Este enfoque también permite la electroporación coherente de desarrollo de las neuronas corticales. Los embriones se extrae del útero y electroporación para introducir ADN plásmido y el telencéfalo es diseccionado a continuación. Cada hemisferio se aísla y se colocan lado medial hacia abajo sobre un filtro revestido con colágeno. El explante se cultivan entonces durante un período de 48 horas, un periodo que abarca dividir la presiembra 8. Durante el período de cultivo, L6 neuronas se desarrollan a partir de precursor a diferenciarse neurona 25, en posición correcta dentro de la placa cortical. A lo largo de este período, el desarrolloneurona está rodeado por el ECM apropiada y tipos de células que se enfrentaría la celda correspondiente en vivo. Este sistema ya ha demostrado su valía en el desciframiento de los eventos celulares que subyacen a la toxicidad del etanol 26, capa 6 y formación presiembra división 7,25.

Protocol

1. Electroporaciones Ex utero con Expression proteína verde fluorescente plásmido Plásmido de ADN soluciones de inyección se preparan con CAG-eGFP ADN 27 diluido a la concentración de trabajo final de 0,33 mg / ml en ddH 2 O. Qiagen Endo-gratis-Maxi Preps se utilizan para purificar el plásmido a partir de bacterias transformadas. Colorante verde rápido en ~ 0,02% (w / v final) se añade a la solución de ADN como un trazador de inyección. Para preparar el área…

Representative Results

La corteza de embriones de roedores exhibe un gradiente transversal neurogenético durante todo el período de desarrollo, de manera que neocórtex lateral es de aproximadamente 1 día más maduro que dorsal medial neocórtex 28. El grueso de la capa 6 neuronas se generan en (es decir, exhiben su final de la fase S) en E12 en la corteza lateral (también llamado campo 40 5) y en E13 en la corteza medial dorsal (también llamado campo 1 5). Dividir la presiembra se inicia aproxim…

Discussion

Hemos mejorado y evaluó un modelo experimental – explantes enteros hemisferio – para el estudio del desarrollo cortical temprano (E13-E15). El modelo ha demostrado ser útil para el análisis de la migración y la diferenciación del linaje neurona excitatoria que constituye la capa 6 de la corteza cerebral 25,37. Las principales ventajas del sistema son: 1) el crecimiento organotípico para DIV 2, 2) la sencillez de la preparación, y 3) el acceso experimental a las neuronas para la electroporación, la man…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones (NINDS NS066071) y el NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Los autores agradecen al Dr. Robert Quinn y el personal del Departamento de Recursos Animales de laboratorio para el cuidado de los animales. Damos las gracias a Judson Belmont para el apoyo técnico, Nicole Belletier de asistencia como miembro de Verano de Investigación de Pregrado (SURF). También agradecemos al Dr. David Cameron y edita los comentarios sobre una versión anterior del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments (optional)
Reagents      
DMEM/F12 + GlutaMAX GIBCO 10565  
G5 Supplement 100X Invitrogen 17503-012  
B27 Serum-Free Suppl. 50X Invitrogen 1504-044  
Pen / Strep Liquid 100X Invitrogen 15140-122  
HBSS 500 ml GIBCO 14025  
Culture insert collagen coated Costar 3492  
Bovine skin gelatin Sigma G9382  
Hoechst 33342 Invitrogen H1399  
Bovine Serum Albumin Sigma 7906  
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362  
Equipment      
BTX 830 Electroporator Harvard Apparatus 450052  
Tweezer electrodes 10mm Harvard Apparatus 450166  
Incubator Billups Rothenberg MIC-101  
Hamilton syringe (5 uL) Hamilton 87930  
Hamilton syringe needle Hamilton 7803-04 Specify 1″ and style 4
Dumont #5 Forceps FST 11251-10  
Fine Scissors Tough Cut 9 cm FST 14058-09  

Riferimenti

  1. Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
  2. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
  3. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
  4. Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
  5. Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
  6. Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
  7. Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
  8. Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
  9. Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
  10. Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
  11. Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
  12. Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
  13. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  14. O’Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
  15. Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
  16. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  17. Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
  18. Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
  19. Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
  20. Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
  21. Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
  22. Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
  23. Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
  24. Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
  25. O’Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
  26. Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
  27. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
  28. Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
  29. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  30. Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
  31. Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
  32. Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
  33. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
  34. McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
  35. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103, 865-872 (2001).
  36. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
  37. Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
  38. O’Dell, R., et al. . Society for Neuroscience. , (2011).
  39. Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
  40. Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
  41. Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
  42. Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
  43. Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).
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Citazione di questo articolo
Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development. J. Vis. Exp. (74), e50271, doi:10.3791/50271 (2013).

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