Summary
Vi beskriver protokoller for vores mus graft arteriosclerois (GA) modeller, der involverer overdrage en mus karsegment ind i en modtager af samme indavlede stamme. Ved tilbagekrydsning yderligere genetiske ændringer i skibets donor kan modellen vurdere effekten af specifikke gener på GA.
Abstract
Graft arteriosclerois (GA), også kaldet allotransplantat vaskulopati, er en patologisk læsion, der udvikler sig over måneder til år i transplanterede organer karakteriseret ved diffus, periferisk stenose af hele graft vaskulære træ. Den mest kritiske komponent i GA patogenese, er spredningen af glatte muskel-lignende celler i intima. Når en human koronararterie segment er indskudt i den infra-renale aorta af immunsvækkede mus, kunne INTIMAS kunne ekspandere som reaktion på adoptivt overførte humane T-celler allogene til arterien donor eller exogene humane IFN-γ i fravær af humane T-celler. Overdrage en mus aorta fra en stamme til en anden musestamme modtager er begrænset som en model for kronisk afstødning hos mennesker, fordi den akutte cellemedieret afstødningsreaktion i denne musemodel helt eliminerer alle donor-afledte vaskulære celler fra transplantat under to, tre uger. Vi har for nylig udviklet to nye mOuse modeller til at omgå disse problemer. Den første model indebærer indskydning af et fartøj segment fra en mandlig mus i en kvindelig modtager af samme indavlede stamme (C57BL/6J). Afstødning i dette tilfælde kun er rettet mod mindre histokompatibilitetsantigener kodes af Y-kromosomet (stede i den mandlige men ikke kvindelige) og afstødningsreaktion at ensues er tilstrækkelig indolent at bevare donor-afledte glatte muskelceller i flere uger. Den anden model indebærer indskyde en arterie segment fra en vildtype C57BL/6J mus donor i en vært mus af samme stamme og køn, som mangler receptoren for IFN-γ efterfulgt af administration af muse IFN-γ (leveret via infektion af mus lever med en adenovirusvektor. Der er ingen afvisning i dette tilfælde som både donor og recipientmus er af samme stamme og køn, men donor glatte muskelceller proliferere som respons på cytokinet mens værtsafledt celler, der mangler receptor fordette cytokin er afvisende. Ved tilbagekrydsning yderligere genetiske ændringer i skibets donor, kan begge modeller anvendes til at vurdere effekten af specifikke gener på GA progression. Her beskriver vi detaljerede protokoller for vores mus GA modeller.
Introduction
Graft arteriosclerois (GA), også kaldet allotransplantat vaskulopati, er en patologisk læsion, der udvikler sig over måneder til år i transplanterede organer karakteriseret ved diffus, periferisk stenose af hele graft vaskulære træ 7.. Tidlige stadier kan forårsage excentriske og fokal stenoser, der er mere tydelig i arterierne, således mere ligner stenoser ses i konventionel åreforkalkning. Hulrummet tab af transplantatkar resultaterne fra intimal ekspansion grund infiltration af værten T-celler og makrofager og især akkumulering af ekstracellulær matrix og på glatte muskler lignende cellerne stammede fra transplantat, vært eller begge 5, 13, 19, at er utilstrækkeligt kompenseret ved passiv fartøj remodellering. I hjerteallografter, er de mest klinisk signifikante læsioner de i epikardielle og intramyocardial koronararterier. I sidste ende vil GA af kranspulsårerne forårsage iskæmisk hjertesvigt. GA er den største årsag til sent hjerte gr.agterude tab. De stenoser GA stopper ved sutur linjer, stærkt implicerer værtsreaktionen podede alloantigener i sin patogenese og fører os til at klassificere GA som en form for kronisk afstødning 3.. Imidlertid kan andre former for arteriel skade øger risikoen for GA, enten ved at øge nettobyrde for skade eller ved at intensivere og / eller modulering af alloimmun respons. Endotelcelle (EF) foring af graft arterier er bevaret i human GA og de mest overfladiske områder af intima støder op til EF foring er stedet hårdest infiltreret af værtsafledt IFN-γ-producerende T-celler og makrofager 11; i nogle patienter GA er forbundet med udvikling af donor-specifikke alloantistoffer der binder til pode EF 16 men skibene viser ringe tegn på den fibrinoid nekrose der er karakteristisk af akut antistof-medieret afstødning 11.
Den mest kritiske komponent i GA patogenese denproliferation af glatte muskel-lignende celler i intima, hvis denne proces kan blive anholdt, GA er usandsynligt, at fremskridt. Tidligere arbejde fra vores gruppe havde vist, at INTIMAS af humane koronararterie segmenter indskudt i infra-renal aorta af immunsvækkede mus ekspandere som reaktion på adoptivt overførte humane T-celler allogene til arterien donor, og at denne proces kunne inhiberes ved at neutralisere humane IFN- γ 18. Desuden exogene humane IFN-γ kan forårsage intima (og mediale) vaskulære glatte muskelceller (VSMC) proliferation i disse arterielle transplantater i fravær af humane T-celler 15, 17. (Det er vigtigt at bemærke, at mennesker og mus IFN-γ ikke krydse arter, udelukker indirekte virkninger på musen vært i denne eksperimentelle system.) Disse humaniseret musemodeller har gavn af opridset human T-celle / vaskulære celleinteraktioner, og intima læsioner er hovedsagelig sammensat af human (dvs. graft-afledte celler)som er blevet observeret i kliniske prøver, men de har ikke helt gentage den kliniske situation, fordi de ignorerer den rolle vært makrofager og muligvis andre celletyper involveret i kliniske transplantation læsioner. En konventionel musemodel af denne proces kunne teoretisk løse dette problem, der supplerer de begrænsninger af det humaniserede model ved at inddrage en komplet værtimmunsystemet og giver den yderligere fordel af at tillade strømmen af muse genetiske metoder, der skal anvendes til GA. De to mest anvendte musemodeller involverer heterotopisk hjerte transplantation og ortotopisk arterie transplantation 1.. De læsioner, der udvikles i arterierne i heterotopisk hjertetransplantater er overvejende udgøres af værtsceller, sandsynligvis af knoglemarv oprindelse, mens intimale celler i arterierne i humane hjertetransplantater er overvejende af graft oprindelse 5, 13, 19. Dette er en væsentlig forskel, der har ført os til at udvikle alternative musemodeller. Indskudten mus aorta fra en stamme til en anden musestamme modtageren er endnu mere begrænset som en model for kronisk afstødning hos mennesker, fordi den akutte cellemedieret afstødningsreaktion i denne musemodel helt eliminerer alle donor-afledte vaskulære celler fra transplantat under to, tre uger 19.. Derfor de efterfølgende ændringer, der ses i det indskudte karsegment alene er en respons på værts celler, der har genbefolket at decellulariserede skibet stillads, hvilket skaber en meget kunstig situation med begrænset relevans som model for ændringerne i transplantatkar der opstår i klinikken. Vi har for nylig udviklet to nye musemodeller at omgå disse problemer 21.. Den første model indebærer indskydning af et fartøj segment fra en mandlig mus i en kvindelig modtager af samme indavlede stamme (C57BL/6J). Den anden model indebærer indskyde en arterie segment fra en vildtype C57BL/6J mus donor i en vært mus af samme stamme og køn, der mangler receptor for IFN-γ (IFN-yR-KO) efterfulgt af administration af muse IFN-γ (leveret via infektion af museleverens med en adenovirusvektor. Her beskriver vi detaljerede protokoller og fordelene ved vores mus GA modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beskrevne protokoller er fokuseret på musen GA modeller. De procedurer kan anvendes til andre podede transplantation modeller. Disse modeller inkluderer humaniseret xenograft (dvs. menneskelige kranspulsåren segmenter indskudt ind i den infra-renal aorta af immunsvækkede mus) og akut afstødning muse GA model (dvs. en mus aorta fra en genetisk stamme til en anden genetisk stamme modtager). Vores beskrevne musemodeller er mere at lukke humane GA læsioner. Den første model indebærer indskydning …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01 HL109420 til WM og AHA 9320033N til LY.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
Riferimenti
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N. Allograft arteriopathy: pathogenesis update. Cardiovasc. Pathol. 13, 33-40 (2004).
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis – Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circ. Res. 100, 622-632 (2007).
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
