Modelli murini per l'arteriosclerosi Graft

Summary

Descriviamo i protocolli per i nostri arteriosclerois innesto del mouse (GA) modelli che comportano l'interposizione di un segmento di vaso del mouse in un destinatario dello stesso ceppo inbred. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, il modello è in grado di valutare l'effetto di geni specifici in GA.

Abstract

Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell'intero albero vascolare del trapianto. Il componente più critico di GA patogenesi è la proliferazione di cellule muscolari lisce-simili all'interno dell'intima. Quando un segmento di arteria coronaria umana è interposto nel aortae infra-renale di topi immunodeficienti, le intimas potrebbero essere espandono in risposta a cellule T umane adoptively trasferiti al donatore allogenico un'arteria o esogena umana IFN-γ in assenza di cellule T umane. Interposizione di una aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente topo è limitato come modello per rigetto cronico nell'uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte derivate dal donatore cellule vascolari del trapianto entro due-tre settimane. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi mOuse modelli per aggirare questi problemi. Il primo modello prevede l'interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Rigetto in questo caso è diretto solo contro antigeni di istocompatibilità minori codificate dal cromosoma Y (presente nel maschio, ma non la femmina) e la risposta di rifiuto che ne deriva è sufficientemente indolente di conservare le cellule muscolari lisce derivate dal donatore per diverse settimane. Il secondo modello prevede l'interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca il recettore per IFN-γ seguita da somministrazione di topo IFN-γ (distribuito mediante infezione del mouse fegato con un vettore adenovirale. Non c'è rigetto in questo caso come donatore e topi riceventi sono dello stesso ceppo e genere ma donatori cellule muscolari lisce proliferano in risposta alla citochina mentre ospitanti cellule derivate, privo recettore perquesta citochina, non rispondono. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, entrambi i modelli possono essere utilizzati per valutare l'effetto di geni specifici sulla progressione GA. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per i nostri modelli di mouse GA.

Introduction

Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell'intero albero vascolare dell'innesto ^7. Fasi precoci possono causare stenosi eccentriche e focale che sono più evidenti nelle arterie, quindi più da vicino assomiglia stenosi visto in aterosclerosi convenzionale. La perdita lume dei vasi dell'innesto risultati espansione intimale causa di infiltrazioni di cellule T e macrofagi ospite e soprattutto per l'accumulo di matrice extracellulare e di muscolo liscio-come cellule originati da trapianto, host o entrambi ^{5, 13, 19,} che è insufficientemente compensata da esterno nave rimodellamento. In allotrapianti cardiaci, le lesioni clinicamente più significative sono quelle nelle arterie coronarie e epicardiche intramiocardica. In definitiva, GA delle arterie coronarie provoca insufficienza cardiaca ischemica. GA è la principale causa di ritardo gr cardiacoperdita di poppa. Le stenosi di GA fermano le linee di sutura, che implica fortemente la risposta dell'ospite a alloantigeni innesto nella sua patogenesi e che ci porta a classificare GA come una forma di rigetto cronico ^3. Tuttavia, altre forme di lesione arteriosa può aumentare il rischio di GA, sia attraverso aumentando il carico netto di lesioni o intensificando e / o modulare la risposta allo immune. La cella (CE) rivestimento endoteliale delle arterie innesto viene conservata in GA umano e le regioni più superficiali del intimale adiacente al rivestimento CE è il sito più pesantemente infiltrati da host-derived IFN-γ-producono cellule T e macrofagi ^11; nella alcuni pazienti GA è associato con lo sviluppo di alloanticorpi donatore-specifici che si legano a innesto EC ¹⁶ ma i vasi mostrano poca prova della necrosi fibrinoide che è caratteristica di rigetto acuto anticorpo-mediata ^11.

Il componente più critico di GA patogenesi è laproliferazione di cellule muscolari lisce-simili all'interno del intima, se questo processo può essere arrestato, GA è improbabile a progredire. Precedente lavoro del nostro gruppo aveva dimostrato che intimas di segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti espandono in risposta a cellule T umane allogeniche adoptively trasferiti al donatore arteria e che questo processo potrebbe essere inibito neutralizzando umana IFN- γ ^18. Inoltre esogeno IFN-γ umano potrebbe causare intimale (e mediale) cellule muscolari lisce (VSMC) proliferazione vascolare in questi innesti arteriosi in assenza di cellule umane T ^{15, 17.} (E 'importante notare che uomo e topo IFN-γ non attraversare specie, escludendo gli effetti indiretti sulla ospite del mouse in questo sistema sperimentale). Questi modelli di topo umanizzato hanno il vantaggio di ricapitolare cellule T umano / interazioni delle cellule vascolari e il intimale Le lesioni sono in gran parte costituiti da cellule umane (cioè graft-derivato),Come è stato osservato in campioni clinici, ma non ricapitolare appieno la situazione clinica perché ignorano il ruolo dei macrofagi ospitanti e forse altri tipi di cellule coinvolte nelle lesioni trapianti clinici. Un modello convenzionale topo di questo processo potrebbe teoricamente risolvere questo problema, integrando le limitazioni del modello umanizzato coinvolgendo un sistema completo immunitario ospite e fornendo l'ulteriore vantaggio di permettere la potenza di approcci genetici topo da applicare a GA. I due modelli di mouse più diffusi riguardano il trapianto di cuore eterotopico e arteria trapianto ortotopico ^1. Le lesioni che si sviluppano nelle arterie dei trapianti di cuore eterotopico sono in gran parte costituiti da cellule ospiti, probabilmente di origine midollare, mentre le cellule intimale delle arterie a innesti cardiaci umani sono prevalentemente di origine innesto ^{5, 13, 19.} Questa è una distinzione importante, che ha portato a sviluppare modelli alternativi del mouse. Interposizione diuna aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente mouse è ancora più limitata come modello per rigetto cronico nell'uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte le cellule vascolari derivate dal donatore dal trapianto entro due-tre ¹⁹ settimane. Di conseguenza, le successive variazioni visti nel segmento del vaso interposto sono solo una risposta di cellule ospiti che hanno ripopolato il decellularized nave patibolo, creando una situazione estremamente artefatta di scarsa rilevanza come modello per i cambiamenti di vasi di innesto che si verificano nella clinica. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi modelli di mouse per aggirare questi problemi ^21. Il primo modello prevede l'interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Il secondo modello prevede l'interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca della receptor per IFN-γ (IFN-γR-KO), seguito da somministrazione di IFN-γ del mouse (distribuito mediante infezione del fegato del topo con un vettore adenovirale. Qui, descriviamo protocolli dettagliati ed i vantaggi dei nostri modelli murini GA.

Protocol

Topo allotrapianto e singenico modello di trapianto di innesto Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e comitati uso di Yale. Per il modello di allotrapianto, segmenti di aorta toracica da maschio, 4-5 settimane vecchia WT (C57BL/6J) o IFN-γR-KO sono stati interposti in aorta addominale del destinatario femminile, 8-12 settimane di età WT utilizzando un end-to -end microchirurgico tecnica anastomotica (vedi successivo per i dettagli). Per il …

Representative Results

Topo modello allotrapianto arteriosclerosi (GA): In questo modello, un donatore maschio aorta viene trapiantato nel ricevente femmina modo che l'host induce risposte allo-mediate da cellule T alloreattive contro un antigene Y minore (il maschio-specifico minore di istocompatibilità HY) espressi sul l'innesto 12, ed a sua volta prodotta da cellule T γ-IFN azionamenti VSMC proliferazione 20 come osservato in altri modelli di trapianto allogenico 2, 6, 8-10, 14. U…

Discussion

I protocolli descritti si concentrano su modelli murini GA. Le procedure possono essere applicate ad altri modelli di trapianto innesto. Questi modelli includono xenotrapianto umanizzato (cioè segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti), e il rigetto acuto del mouse modello GA (cioè una aorta mouse da un ceppo genetico in un altro ceppo ricevente genetica). I nostri modelli murini descritti sono più per chiudere le lesioni GA umani. Il primo m…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
			Table 2. Specific reagents and equipment.