Mus Modeller for Graft Arteriosclerosis

Summary

Vi beskriver protokoller for våre mus pode arteriosclerois (GA) modeller som innebærer interposition av en mus fartøy segmentet til en mottaker av samme innavlet stamme. Ved tilbakekryssing flere genetiske forandringer i skipet donor, kan modellen vurdere effekten av spesifikke gener på GA.

Abstract

Graft arteriosclerois (GA), også kalt allograft vaskulopati, er en patologisk lesjon som utvikler seg over måneder eller år i transplanterte organer karakterisert ved diffus, omkrets-stenose av hele graftet vaskulære treet. Den mest kritiske del av GA patogenesen er proliferasjonen av glatte muskel-lignende celler i intima. Når et menneske koronararterie segment er innskutt inn i det nedenfor nyrene-aorta av immundefekte mus, kunne bli intimas ekspandere som respons på adoptively overførte humane allogene T-celler til arterien donor eller eksogen human IFN-γ i fravær av humane T-celler. Interposition av en mus aorta fra en stamme til en annen mus belastning mottaker er begrenset som en modell for kronisk avvisning hos mennesker fordi den akutte celle-mediert avvisning respons i denne musemodellen fullstendig eliminerer alle donor-deriverte celler fra den vaskulære transplantat innenfor to til tre uker. Vi har nylig utviklet to nye mOuse modeller for å omgå disse problemene. Den første modellen involverer interposition av et fartøy segment fra en hann mus i en kvinnelig mottager av den samme innavlet stamme (C57BL/6J). Transplantatavstøtning i dette tilfellet er rettet kun mot mindre histocompatibility antigener kodet av Y-kromosom (tilstede i den mannlige men ikke den hunn) og den avvisende reaksjon som følger er tilstrekkelig lat for å bevare donor-deriverte glatte muskelceller i flere uker. Den andre modellen innebærer interposing en arterie segment fra en villtype C57BL/6J mus donor i en vert mus av samme stamme og kjønn som mangler reseptoren for IFN-γ etterfulgt av administrering av mus-IFN γ (levert via infeksjon i mus liver med en adenoviral vektor. Det er ingen avvisning i dette tilfelle både som giver-og mottaker-mus er av samme stamme og kjønn, men donor glatte muskelceller spre seg i respons på cytokin mens verts-avledede celler, mangler reseptor fordette cytokin, reagerer ikke. Ved tilbakekryssing flere genetiske forandringer i skipet donor, kan begge modellene brukes til å vurdere effekten av spesifikke gener på GA progresjon. Her beskriver vi detaljerte protokoller for våre mus GA-modeller.

Introduction

Graft arteriosclerois (GA), også kalt allograft vaskulopati, er en patologisk lesjon som utvikler seg over måneder eller år i transplanterte organer karakterisert ved diffus, omkrets-stenose av hele graftet vaskulære tre ^7. Tidlige stadier kan forårsake eksentriske og fokale stenoser som er mer opplagt i arteries, og dermed nærmere ligner stenoser sett i konvensjonell aterosklerose. Lumen tap av graftet fartøy resultatene fra intimal utvidelse på grunn av infiltrering av vert T-celler og makrofager, og spesielt til akkumulering av ekstracellulær matriks og glatte muskel-celler som stammer fra transplantatet, vert eller begge ^{5, 13, 19,} som er tilstrekkelig kompensert av ytre fartøy ombygging. I kardiale allografts, de klinisk signifikante lesjoner er de i epikardiale og intramyocardial koronararteriene. Til syvende og sist vil GA av koronararteriene forårsake iskemisk hjertesvikt. GA er den viktigste årsaken til sent hjertestans grakterut tap. De stenose i GA stoppe på suture linjene, sterkt implicating verten respons til pode alloantigener i patogenesen sin, og fører oss til å klassifisere GA som en form for kronisk avvisning ^tre. Imidlertid kan andre former for arteriell skade øke risiko for GA, enten ved å øke den netto byrden av skade eller ved å forsterke og / eller modulere alloimmun respons. Den endotelceller (EF) foring av pode arteries er bevart i menneskelig GA og de ​​mest overfladiske regioner av intima tilknytning til EF fôr er stedet mest tungt infiltrert av host-derived IFN-γ-produserende T-celler og makrofager ^11, i noen pasienter GA er forbundet med utvikling av donor-spesifikke alloantibodies som binder til pode EC ¹⁶ men fartøyene lite tydelig av den fibrinoid nekrose som er karakteristisk for akutt antistoff-mediert avvisning ^11..

Den mest kritiske del av GA patogenesen erspredning av glatte muskel-lignende celler i intima, hvis denne prosessen kan bli arrestert, er GA usannsynlig å gå videre. Tidligere arbeid fra gruppe vår hadde vist at intimas fra humane koronararteriespasmer segmenter innskutt inn i det nedenfor nyrene-aorta av immundefekte mus ekspandere som respons på adoptively overførte humane allogene T-celler til arterien donor, og at denne prosess kunne inhiberes ved å nøytralisere human IFN- γ ^18. Videre eksogen human IFN-γ kunne forårsake intimal (og mediale) vaskulære glatte muskelceller (VSMC) proliferasjon i disse arterielle grafts i fravær av humane T-celler ^{15, 17.} (Det er viktig å merke seg at mennesker og mus IFN-γ ikke krysse arter, utelukker indirekte virkninger på mus vert i denne eksperimentelle systemet.) Disse humanisert musemodeller har fordelen av rekapitulere human T-celle / vaskulære celle interaksjoner og intimal lesjoner er i stor grad består av mennesker (dvs. graft-avledet) celler,som har blitt observert i kliniske prøver, men de har ikke fullt rekapitulere den kliniske situasjonen fordi de ignorerer rollen som vert makrofager og eventuelt andre celletyper som er involvert i kliniske transplantasjon lesjoner. En vanlig mus modell av denne prosessen kan teoretisk løse dette problemet, sammenfallende med begrensningene av humanisert modellen ved å involvere en hel rekke immunsystem og gir den ekstra fordelen av å la kraften av mus genetiske metoder som skal brukes til GA. De to mest brukte mus modeller innebære heterotop hjertetransplantasjon og orthotopic arterie transplantasjon ^en. Lesjoner som utvikler seg i arteriene i heterotop hjerte grafts er i stor grad består av vertscellene, sannsynligvis av benmargen opprinnelse, mens intimale celler i arteriene i menneskets hjerte grafts er hovedsakelig av pode opprinnelse ^{5, 13, 19.} Dette er en betydelig forskjell som har ført oss til å utvikle alternative mus modeller. Interposition aven mus aorta fra en stamme til en annen mus belastning mottaker er enda mer begrenset som en modell for kronisk avvisning hos mennesker fordi den akutte celle-mediert avvisning respons i denne musemodellen fullstendig eliminerer alle donor-deriverte celler fra vaskulære transplantatet innenfor to til tre uker ^19. Følgelig de påfølgende endringer sett i interposed fartøy segmentet er utelukkende en reaksjon av verten celler som har skar den decellularized fartøy stillas, skaper en svært kunstig situasjon med begrenset relevans som en modell for endringer i pode fartøy som oppstår i klinikken. Vi har nylig utviklet to nye musemodeller å omgå disse problemene ^21. Den første modellen involverer interposition av et fartøy segment fra en hann mus i en kvinnelig mottager av den samme innavlet stamme (C57BL/6J). Den andre modellen innebærer interposing en arterie segment fra en villtype C57BL/6J mus donor inn i en rekke mus av samme stamme og kjønn som mangler receptor for IFN-γ (IFN-γR-KO) etterfulgt av administrering av mus IFN-γ (levert via smitte av musen lever med en adenovirusvektor. Her beskriver vi detaljerte protokoller og fordelene ved våre mus GA-modeller.

Protocol

Mus allograft og syngen pode transplantasjon modell Alle dyrestudier ble godkjent av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteer ved Yale University. For allograft modell, ble deler av thorakalaorta fra mannlig, 4-5 uker gamle WT (C57BL/6J) eller IFN-γR-KO mus anbragt i abdominal aorta av kvinnelige mottaker, 8-12 uker gamle WT bruker en ende-til -end microsurgical anastomotisk teknikk (se neste for detaljer). For syngen pode modell, ble deler av thorax aorta fra mannlige, 4-5 uker gamle W…

Representative Results

Mus allograft arteriosklerose (GA) modell: I denne modellen er en mannlig donor aorta transplantert inn kvinnelige mottaker, slik at det vert induserer alloreactive T celle-medierte alloimmun respons mot en mindreårig Y antigen (den mannlige-spesifikke mindre histocompatibility antigen HY) uttrykt på transplantatet 12, og i sin tur T-celle-produsert IFN-γ stasjoner VSMC proliferasjon 20 som observert i andre allograft transplantasjon modeller 2, 6, 8-10, 14.. Et segme…

Discussion

De beskrevne protokoller er fokusert på mus GA-modeller. Prosedyrene kan anvendes for andre pode transplantasjonsformål modeller. Disse modellene inkluderer humanisert xenograft (dvs. menneskelige koronar segmenter innskutt i infra-renal aorta av immunsvikt mus) og akutt avvisning mus GA-modellen (dvs. en mus aorta fra en genetisk sil over i en annen genetisk belastning mottaker). Våre beskrevet mus modeller er mer å lukke menneskelige GA lesjoner. Den første modellen involverer interposition av e…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
			Table 2. Specific reagents and equipment.