Musmodeller för Graft åderförkalkning

Summary

Vi beskriver protokoll för våra arteriosclerois mus transplantat (GA) modeller som innefattar en mellanliggande mus kärlsegment till en mottagare av samma inavlade stam. Genom tillbakakorsning ytterligare genetiska förändringar i kärlet donator, kan modellen bedöma effekten av specifika gener på GA.

Abstract

Graft arteriosclerois (GA), även kallad transplantatvaskulopati, är en patologisk lesion som utvecklas över flera månader eller år i transplanterade organ kännetecknas av diffus, omgivande stenos i hela vaskulär träd. Den mest kritiska komponenten i GA patogenes är tillväxten av glatta muskel-liknande celler i intima. När en human kransartär segmentet är insatt in i den infra-renala aorta av immundefekta möss, kunde intimas skall expandera som svar på adoptivt överförda humana T-celler allogena till artären donator eller exogent humant IFN-γ i frånvaro av humana T-celler. En mellanliggande mus aorta från en stam till en annan musstam mottagare är begränsad som en modell för kronisk avstötning hos människor eftersom det akuta cell-medierad avvisande svar i denna musmodell helt eliminerar alla givare-härledda vaskulära celler från transplantat inom två-tre veckor. Vi har nyligen utvecklat två nya mouse modeller för att kringgå dessa problem. Den första modellen innebär en mellanliggande kärlsegment från en manlig mus in i en kvinnlig mottagare av samma inavlade stam (C57BL/6J). Transplantatavstötning i detta fall är riktad endast mot smärre histokompatibilitetsantigener kodade av Y-kromosomen (närvarande i manliga men inte kvinnliga) och avstötningsreaktioner som följer är tillräckligt loj att bevara donator-härledda glatta muskelceller i flera veckor. Den andra modellen innebär anbringande av en artär segment från en vild typ C57BL/6J mus givare i en värd mus av samma stam och kön som saknar receptorn för IFN-γ följt av administrering av mus-IFN-γ (levereras via infektion av musen levern med en adenoviral vektor. Det finns ingen avstötning i detta fall eftersom både givare och möss mottagare är av samma stam och kön men donor glattmuskelceller proliferera som svar på cytokinet medan värd-härledda celler, som saknar receptorn fördetta cytokin, svarar inte. Genom tillbakakorsning ytterligare genetiska förändringar i kärlet donator, kan båda modellerna kan användas för att bedöma effekten av specifika gener på GA progression. Här beskriver vi detaljerade protokoll för vår mus GA-modeller.

Introduction

Graft arteriosclerois (GA), även kallad transplantatvaskulopati, är en patologisk lesion som utvecklas över flera månader eller år i transplanterade organ kännetecknas av diffus, omgivande stenos i hela vaskulär träd ^7. Tidiga skeden kan orsaka excentriska och fokal stenoser som är mer uppenbart i artärerna, vilket närmare liknar stenoser ses i konventionella ateroskleros. Lumen avstötning av transplantatet till fartyg resulterar från intimal expansion på grund av infiltration av celler värd-T och makrofager och speciellt till ackumulering av extracellulär matrix och glatt muskulatur-liknande celler härstammar från transplantat, värd eller båda ^{5, 13, 19,} som är otillräckligt kompenseras genom passiv fartyg ombyggnad. I hjärt allografts, de mest kliniskt signifikanta lesioner är de i epikardiella och intramyocardial kranskärl. I slutändan kommer GA i kranskärlen orsakar ischemisk hjärtsvikt. GA är den största orsaken till sent hjärt grakterut förlust. De stenoser GA stannar vid sutur linjer, starkt binder värdsvaret att ympa alloantigener i dess patogenes och leder oss att klassificera GA som en form av kronisk avstötning ^3. Emellertid kan andra former av arteriell skada ökar risken för GA, antingen genom att öka nettobörda av skada eller genom att intensifiera och / eller modulera alloimmun svar. Den endotelcell (EG) beklädnad av transplantat artärer bevaras i human GA och de mest ytliga regionerna av intima intill EG fodret är platsen tyngst infiltrerats av värd-härledd IFN-γ-producerande T-celler och makrofager ^11; i vissa patienter GA är förknippade med utvecklingen av donator-specifika alloantikroppar som binder till transplantatet EC ¹⁶ men fartygen visar få tecken på den fibrinoid nekros som är kännetecknande för akut antikropp-medierad avstötning ^11.

Den mest kritiska komponenten i GA patogenes ärproliferation av glatta muskel-liknande celler i intima, om denna process kan bli arresterad, är GA osannolikt att utvecklas. Tidigare arbete från vår grupp hade visat att intimas av mänskliga kransartärsjukdomar segment insatt in i den infra-renala aorta av immundefekta möss expandera som svar på adoptivt överförda humana T-celler allogena till artären donator och att denna process kunde hämmas genom att neutralisera humant IFN- γ ^18. Vidare exogen human IFN-γ kan orsaka intimal (och mediala) vaskulära glatta muskelceller (VSMC) spridning i dessa arteriella transplantat i frånvaro av humana T-celler ^{15, 17.} (Det är viktigt att notera att människa och mus IFN-γ korsar inte arter, utesluter indirekta effekter på musen värd i denna experimentella systemet.) Dessa humaniserade musmodeller har förmånen att rekapitulera human T-cell / vaskulära interaktioner cell och intimala lesioner är till stor del består av humana (dvs. transplantat-härledda) celler,som har observerats i kliniska prover, men de har inte fullt rekapitulera den kliniska situationen eftersom de ignorerar den roll som värd makrofager och eventuellt andra celltyper som deltar i kliniska transplantationer lesioner. En konventionell mus modell av denna process skulle teoretiskt ta itu med detta problem, komplettera begränsningarna av humaniserad modellen genom att involvera ett komplett värdimmunsystemet och ger den ytterligare fördelen att kraften i musen genetiska metoder som ska tillämpas till GA. De två mest använda musmodeller involverar heterotop hjärttransplantation och orthotopic artär transplantation ^1. De skador som utvecklas i artärerna i heterotopiska hjärttransplantat är till stor del består av värdceller, troligen av benmärg ursprung, medan intima celler i artärerna i mänskliga hjärttransplantat är övervägande av transplantat ursprung ^{5, 13, 19.} Detta är en viktig distinktion som har fått oss att utveckla alternativa musmodeller. Mellanlägg aven mus aorta från en stam till en annan musstam mottagare är ännu mer begränsad som en modell för kronisk avstötning hos människor eftersom den akut cell-medierad avvisande svar i denna musmodell helt eliminerar alla givare-härledda vaskulära celler från transplantat inom två-tre veckor ^19. Följaktligen, de efterföljande förändringarna ses i det mellanliggande kärlsegmentet är enbart ett svar på värdceller som har återpopuleras den decellulariserade fartyget schavotten, skapa ett starkt artefaktuella situation av begränsad betydelse som förebild för de förändringar i transplantatet fartyg som förekommer i kliniken. Vi har nyligen utvecklat två nya musmodeller för att kringgå dessa problem ^21. Den första modellen innebär en mellanliggande kärlsegment från en manlig mus in i en kvinnlig mottagare av samma inavlade stam (C57BL/6J). Den andra modellen innebär anbringande av en artär segment från en vild typ C57BL/6J mus givare i en värd mus av samma stam och kön som saknar receptor för IFN-γ (IFN-yR-KO) följt av administrering av mus-IFN-γ (levereras via infektion i muslever med en adenoviral vektor. Här beskriver vi detaljerade protokoll och fördelarna med våra mus GA modeller.

Protocol

Mus allograft och syngena transplantat transplantation modell Samtliga djurstudier har godkänts av Institutional Animal Care och kommittéer användning av Yale University. För transplantatavstötning modell, var segment av aorta från manlig, 4-5 veckor gamla WT (C57BL/6J) eller IFN-yR-KO möss insatt i bukaorta av kvinnlig mottagare, 8-12 veckor gamla WT med en end-to -end mikrokirurgisk anastomotic teknik (se nästa för detaljer). För syngen transplantat modellen var segment av bröstkor…

Representative Results

Mus allograft arterioskleros (GA) modell: I denna modell är en manlig donator aorta transplanteras in kvinnliga mottagaren så att den mottagande inducerar alloreaktiva T-cells medierade alloimmuna svar mot en mindre Y-antigen (den manliga-specifika underordnade histokompatibilitetsantigenet HY) uttrycks på transplantatet 12, och i sin tur T-cell-producerade IFN-γ enheter VSMCs proliferation 20 som observerats i andra modeller allograft transplantation 2, 6, 8-10, 14….

Discussion

De beskrivna protokollen är fokuserade på mus GA-modeller. Förfarandena kan tillämpas på andra graft transplantation modeller. Dessa modeller inkluderar humaniserad xenotransplantat (dvs. mänskliga kranskärl segment insatt i den infra-renala aorta av möss med immunbrist), och akut avstötning mus GA-modellen (dvs. en mus aorta från en genetisk stam till en annan genetisk stam mottagare). Våra beskrivna musmodeller är mer att stänga mänskliga GA lesioner. Den första modellen innebär en me…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
			Table 2. Specific reagents and equipment.