Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.
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Articolo metodologico
Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti batteri patogeni intracellulari utilizzare protozoi d'acqua dolce come un serbatoio naturale per la proliferazione nell'ambiente. Legionella pneumophila, l'agente eziologico della legionario 'polmonite, guadagna un vantaggio su di batteri patogeni in vitro in coltura al momento della prima raccolti da cellule protozoi prima infezione di macrofagi mammiferi. Questo suggerisce che i fattori di virulenza importanti non possono essere adeguatamente espresse in vitro. Abbiamo sviluppato un sistema per l'adescamento trattabile L. pneumophila attraverso il suo naturale ospite protozoo Acanthamoeba castellanii prima dell'infezione cellula di mammifero. Il contributo di ogni fattore di virulenza può essere esaminata confrontando la crescita intracellulare di un ceppo mutante di wild-type batteri dopo aver riempito protozoo. GFP che esprimono L. wild-type e mutante ceppi pneumophila sono utilizzati per infettare monostrati protozoi in fase di caricamento, e ha permesso di raggiungere ultime fasi della crescita intracellulare. Batteri fluorescenti vengono quindi raccolte da queste cellule infette e normalizzati per spettrofotometria per generare numeri comparabili di batteri per una successiva infezione in macrofagi mammiferi. Per la quantificazione, batteri vivi sono monitorati dopo l'infezione usando la microscopia a fluorescenza, citometria a flusso, e mediante placcatura colonia. Questa tecnica mette in evidenza e si avvale del contributo della cellula ospite-dipendente l'espressione del gene imitando l'ambiente che si può incontrare in un percorso di acquisizione naturale. Questo approccio può essere modificato per ospitare qualsiasi batterio che utilizza un host intermediario come un mezzo per ottenere un vantaggio patogeno.
Introduzione
Numerosi batteri patogeni si sono adattati strategie generalizzate per sfruttare cellule ospiti per la sopravvivenza e la replicazione in un compartimento intracellulare. In molti casi, i meccanismi patogenetici sono simili tra protozoi e metazoi le cellule. Tuttavia, questi due microambienti sono molto diversi e possono provocare un'espressione differenziale di fattori di virulenza 1-4. Il batterio della malattia del legionario 'Legionella pneumophila è ubiquitariamente associati agli ambienti d'acqua dolce in tutto il mondo 5. È importante sottolineare che, L. pneumophila coltivato in cellule protozoarie prima inf....
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Protocollo
1. Preparazione di Legionella pneumophila Culture per le infezioni della fase di priming
- Trasforma tutti L. ceppi pneumophila usare nel saggio con le plasmide pAM239, codificante un isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) inducibile proteina fluorescente verde (GFP) 28. Streak i ceppi batterici sul ferro e cisteina integrato N-(2-acetammido)-2-acido aminoethanesulfonic (ACES) tamponata agar carbone estratto di lievito (CYEA) contenente 6,25 mg / ml di cloramfenicolo (CM) (per manutenzione plasmide) e incubare per 72 hr a 37 ° C.
- Trasferire un inoculo del ceppo batterico in ACES integrate ....
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Risultati
Un risultato tipico per l'intero processo di infezione è descritto nella Figura 1. Vivo delle cellule al microscopio a fluorescenza che raffigurano monostrati di A.castellanii infettati con wild-type L. pneumophila durante la fase di adescamento è mostrato nella Figura 1A. Una misura di successo della fase di caricamento porterebbe ad una popolazione di circa il 90% delle cellule ospiti contenenti grandi vacuoli popolate con batteri GFP etichettati in questo MOI. A.......
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Discussione
Espressione genica batterico è strettamente controllata mediante una combinazione di progressione del ciclo di vita e di risposta ai segnali nel microambiente circostante. Vacuolare patogeni come L. pneumophila rispondere a una moltitudine di cellula ospite derivati spunti quando compartimenti stagni in un phagosome. Come risultato collettivo di esaurimento nutrienti nella cellula ospite, il batterio compensa esprimendo fattori richiesti per diffusione successo ad una cellula ospite successivo 25. .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Craig Roy e il Dr. Dario Zamboni per fornire un modello per le infezioni delle cellule protozoi. Ringraziamo il Dott. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, il Dr. Fred Heffron e Todd Wisner per le attrezzature e reagenti, il dottor Lulu Cambronne per la revisione critica del manoscritto. La citometria a flusso è stata eseguita presso l'impianto di flusso di risorse OHSU Citometria condivisa. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione della Fondazione per la Ricerca Medica dell'Oregon e una sovvenzione del NIH R21 AI088275 (EDC).
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Materiali
Equipment
carbone al carbone td colspan="4"> software da
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotico |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth medium for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | salino tamponato con fosfato |
| attivo | Fisher Scientific | C272-212 | componente del terreno |
| estratto di lievito | Fisher Scientific | BP1422-500 | componente del terreno |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | componente del terreno |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| L-cisteina, 99%+ | Acros organics | 173601000 | integratore di terreni |
| nitrato ferrico nonaidrato | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement< |
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | microscopio a fluorescenza |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spettrofotometro |
| 5810 R centrifuga | Eppendorf | 22627023 | centrifuga da banco |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 pipetta ripetuta | |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | lettore di micropiastre | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | software per lettore di micropiastre |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | da tavolo microcentrifuga |
| Pompa per pipette a rilascio rapido II | Scienceware | 379111010 | pipetta |
| FACS Calibur | BD Bioscience | citometro | |
| a flusso FlowJo 7.6.1 | FlowJo | per citometria a flusso | con licenza |
| 15 ml | BD Falcon | 352096 | tubo conico in polipropilene tubo da |
| 1,6 ml | Neptune | 3745.X | Provette per microcentrifuga |
Riferimenti
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection ....
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Ristampe e permessi
