La registrazione dell'attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Sommario

In questo video, dimostreremo come registrare l'attività elettrica di singoli neuroni identificati in una preparazione cervello intero, che preserva i circuiti neurali complessi. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con una proteina fluorescente per l'identificazione nella preparazione cervello intatto.

Abstract

Comprendere la fisiologia delle cellule di circuiti neurali che regolano i comportamenti complessi è notevolmente migliorata utilizzando sistemi modello in cui questo lavoro può essere eseguito in una preparazione intatto cervello in cui i circuiti neurali del sistema nervoso centrale rimane intatto. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con proteina fluorescente verde per l'identificazione nel cervello intatto. I pesci hanno molteplici popolazioni di neuroni GnRH, e le loro funzioni sono dipendenti dalla loro posizione nel cervello e il gene GnRH che essi esprimono ^1. Abbiamo focalizzato la nostra dimostrazione GnRH3 neuroni situati nei nervi terminali (TN) associati ai bulbi olfattivi con il cervello intatto del transgenico Medaka pesce (Figura 1B e C). Studi suggeriscono che Medaka TN-GnRH3 neuroni sono neuromodulatori, che agisce come un trasmettitore di informazioni dall'ambiente esterno al sistema nervoso centrale; tehi non svolgono un ruolo diretto nel regolare le funzioni di ipofisi-gonadi, così come il ben noto ipotalamico GnRH1 neuroni ^{2, 3.} L'andamento tonico di azione spontanea potenziale di scarica dei neuroni TN-GnRH3 è una proprietà intrinseca ^4-6, la frequenza delle quali è modulata da segnali visivi da conspecifici ² e il neuropeptide kisspeptin 1 ^5. In questo video, si usa una linea stabile di Medaka transgenici in cui i neuroni TN-GnRH3 esprimono un transgene contenente la regione del promotore del Gnrh3 legato alla maggiore proteina fluorescente verde ⁷ per mostrare come identificare i neuroni e monitorare la loro attività elettrica in tutto il cervello preparazione ^6.

Protocollo

1. Dissezione di Brains da adulti Medaka

1. Anestetizzare adulto di sesso maschile o femminile (Figura 1A) immergendo in 5 ml di MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), attendere un paio di minuti dopo i movimenti branchie hanno cessato prima di decapitare. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa della University of California-Los Angeles.
2. Decapitare il pesce in soluzione salina di pesce alla fine caudale della opercolo con le forbici in una capsula di Petri del diametro di 60 mm.
3. Trasferimento testa di pesce ad un diametro piastra di Petri di 35 mm, riempito a metà con il pes....

Risultati

Un esempio di cluster bilaterali di GFP-etichettati TN-GnRH3 neuroni dal cervello asportato di Medaka pesci sono mostrati nelle figure 1B e 1C. Ogni cluster contiene circa 8-10 neuroni GnRH. Le attività neuronali spontanee del target TN-GnRH3 sono stati registrati in modalità di corrente-clamp (I = 0) con tassi di cottura tipiche di 0,5-6 Hz. Il modello di potenziale d'azione di cottura è in genere un modello di tonico o battere, con un intervallo di interspike abbastanza regolare. .......

Discussione

GnRH 3: GFP transgenici pesci forniscono modelli unici per studiare i meccanismi neurofisiologici alla base di integrazione neuronale e la regolamentazione nel controllo centrale di comportamenti che sono direttamente e indirettamente coinvolti nella riproduzione ^{3, 8-10.} Uno dei vantaggi significativi di questo modello di sistema è che molti GnRH3 neuroni esprimono GFP sono vicini alla superficie ventrale del cervello, consentendo relativamente facile accesso ai neuroni di registrazione elettrofisio.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio	Olympus		BX50W (verticale)
Amplificatore	Axon Instruments		Axoclamp 200B
Convertitore A-D	Computer Interference Corp.		Digidata ITC-18
Telecamera CCD raffreddata	PCO Ottica del		Sensicam
Lampada allo xeno	Sutter Instruments Co.
Set di filtri GFP Chroma	Technologies
Software di imaging	Intelligent Imaging Innovations		Software Slidebook
Software di acquisizione dati per elettrofisiologia	Axon Instruments		Software per assografo
Software di acquisizione dati per elettrofisiologia	AD Instruments Inc.		PowerLab
Headstage per elettrofisiologia	Axon Instruments		CV 203BU
Micromanipolatore	Sutter Instrument Co	MP-285
Camera di registrazione Piattaforma	Warner Instrument Corp.		Camera di registrazione P1
	Warner Instrument Corp.		RC-26G
Estrattore di elettrodi	Sutter instruments		P87
Filamento per estrattore di elettrodi	Sutter Instruments	FB330B	Filamento di canale largo 3,0 mm
Capillari in vetro da 1,5 mm	World Precision Instruments	1B150-4	Micr– Lettore per la registrazione
Siringa	Becton Dickinson	309586	3 ml
MS-222	Sigma	E10521-10G	Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato sale
Soluzione salina			di pesce mM: 134 NaCl; 2,9 KCl; 2,1 CaCl2; 1,2 MgCl2; 10 HEPES
Soluzione di elettrodo (loose-patch)			mM: 150 NaCl; 3,5 KCl; 2.5 CaCl2; 1,3 MgCl2; 10 HEPES; 10
glucosio Soluzione di elettrodi (cerotto a cellula intera)			mM: 112,5 K-gluconato; NaCl; 17,5 KCl; 0,5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0,1 leupeptina; 10 fosfo-creatina

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