Langsigtet undertrykkelse af Intersectin-1s i muselunger ved Gentagen leveringen af en specifik siRNA via kationiske liposomer. Evaluering af Knockdown Effects ved elektronmikroskopi
Summary
Gentagne retro-orbital injektioner af kationiske liposomes/siRNA/ITSN-1s komplekser i mus, hver 72. time i 24 dage effektivt levere siRNA dupleks til muselunge mikrovaskulatur reducere ITSN-1s-mRNA og protein ekspression ved 75%. Denne teknik er meget reproducerbar i en dyremodel, har ingen bivirkninger og undgår dødsfald.
Abstract
Tidligere undersøgelser har vist, at knockdown af ITSN-1s (KD ITSN), en endocytisk protein involveret i reguleringen af lunge vaskulær permeabilitet og endotelceller (EC'er) overlevelse, induceret apoptotisk celledød, en væsentlig hindring for udviklingen af en cellekultur-system med forlænget ITSN-1s hæmning 1.. Brug kationiske liposomer som bærere, vi udforskede undertrykkelse af ITSN-1s-genet i mus lunger ved systemisk administration af siRNA rettet ITSN-1-genet (siRNA ITSN). Kationiske liposomer har flere fordele for siRNA levering: sikker med gentagen dosering, immunogent, ikke-toksisk, og let at fremstille 2. Liposomer ydeevne og biologisk aktivitet afhænge af deres størrelse, ladning, lipid sammensætning, stabilitet dosis og administrationsvej 3 Her, effektiv og specifik KD ITSN i muselunger er opnået ved hjælp af en kolesterol og dimethyl dioctadecyl ammoniumbromid kombination. Intravenøs leveringaf siRNA ITSN / kationiske liposomkomplekser forbigående bankede ned ITSN-1s protein og mRNA i muselunger på dag 3, som inddrives efter yderligere 3 dage. Drage fordel af de kationiske liposomer som en gentagelig sikker bærer, undersøgelsen forlænges med 24 dage. Således blev retroorbitale behandling med frisk genererede komplekser administreret hver 3. dag, overtalelse vedvarende KD ITSN hele undersøgelsen 4.. Musevæv indsamlet på flere tidspunkter efter-siRNA ITSN blev underkastet elektronmikroskopi (EM) analyser for at vurdere virkningerne af kronisk KD ITSN, i lunge endotel. Høj opløsning EM imaging tilladt os at vurdere de morfologiske ændringer forårsaget af KDITSN i lungerne vaskulære seng (dvs. afbrydelse af endotel barriere, nedsat antal af caveolae og opregulering af alternative transportveje) egenskaber ikke-påviselige ved lysmikroskopi. Samlet disse fund etableret en vigtigtig rolle ITSN-1s i ECS funktion og lunge homeostase, mens illustrerer effektiviteten af siRNA-liposomer levering in vivo.
Introduction
Naked siRNA kan ikke trænge ind i cellemembranen, er negativt ladede og det er let nedbrydes af enzymer i blod, væv og celler. Selv med nylig strukturelle ændringer for at forbedre stabiliteten, er siRNA ophobning på målet stedet efter administration ekstremt lave og kræver en effektiv intracellulær køretøj 5.. Kationiske liposomer opstod som sikre nukleinsyrer bærere med potentiale til at overføre store stykker DNA / RNA i celler ved at indkapsle og beskytte nukleinsyrer fra enzymatisk nedbrydning 6.. Også kationiske liposomer spontant interagerer med DNA / RNA, således at fremme genoverførsel til cellerne 2. For nylig liposomer er blevet anvendt til at levere vacciner og lav molekylær vægt narkotika 7. Liposomal levering af microRNA-7-udtrykkende plasmid overvinder epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinase inhibitor-resistens i lungecancerceller 8. Når målrettevaskulære endotel, intravenøs levering er afgørende, fordi komplekserne er usandsynligt at krydse endotel barriere og ekstravasere ind i interstitium 9.. Ved sammenligning med andre organer, ECS fra mikrovaskulaturen af lungen har den største optagelse og ivrigt internalisere kationisk liposom og DNA / RNA-komplekser, efterfulgt af lymfeknuder og Peyers patches 9. Intravenøs levering i gnavermodeller for siRNA via retro-orbital eller haleveneinjektioner er bevist uskadelige selv i høje koncentrationer, såsom 50 mg / kg 10. I den offentliggjorte litteratur sammensætningen af kationiske liposomer adskiller baseret på lipider formulering og deres ækvimolært forhold 11, 12. Der er en bred vifte af mulige applikationer ved hjælp af kationiske liposomer til genadministration in vivo, hvorvidt målrettet down-regulation/over-expression af proteinerne, levering af vacciner eller anti-tumor terapier 13-15. Vigtigt at huskeer, at effektiviteten af DNA / RNA-cellulære membran vekselvirkning reguleres af formen kobling mellem genererede komplekser og membranlipider. Dette tyder på, at skræddersy lipider sammensætning til målrettede cellulære membran profiler kan være gavnligt og resultere i høje transfektion i en bestemt celletype 6..
Protocol
Representative Results
Discussion
Baseret på tidligere undersøgelser offentliggjort af andre 9 og os 1, 18 vi udviklet denne metode for langsigtet vælte af ITSN-1s in vivo ved gentagen intravenøs administration (hver 72 timer for 24 på hinanden følgende dage) for specifik siRNA / liposomkomplekser. Denne eksperimentelle fremgangsmåde er effektiv, kan anvendes sikkert og gentagne gange, og det kan nemt udvides til at studere inddragelse af et gen kodende for ethvert protein af interesse i lunge endotel og pulmonal ho…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health Tilskud R01HL089462 til SP.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) | Sigma-Aldrich | D2779 | |
| LiposoFast stabilizer (mini-extruder) | Avestin Inc. | LF-STB | |
| Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore | Avestin Inc. | LFM-50 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8667 | |
| Chloroform | Mallinckrodt Chemicals | 4432-04 | |
| Hank’s balanced salts | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Round-bottom flask | Fisher Scientific | FHB-275-030X | |
| Mouse siRNAITSN – on target | Dharmacon/ThermoScientific | J-046912-11 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | REGLO-CDF digital with RHOO pump head | |
| Ventilator | Hugo Sachs Electronik | NA | |
| Barbital | Sigma-Aldrich | B-0500 | |
| Uranyl acetate | EM Sciences | 22400 | |
| Epon812 | EM Sciences | Discontinued by the manufacturer | |
| Propylene oxide | EM Sciences | 20400 | |
| Embedding molds | EM Sciences | 69923-05 | |
| Tannic acid | EM Sciences | 21710 | |
| 8 nm gold-albumin tracer | Prepared in the laboratory as in16 | ||
| Comments | |||
| Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1) | |||
| Pyrex, 100 ml | |||
| Modified siRNA, in vivo | |||
| Part of IDEX corp. | |||
| D-79232 March, Germany | |||
| Replaced with Embed812, cat. # 14120 |
Riferimenti
- Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
- Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
- Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
- Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
- Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
- Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
- Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
- McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
- Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
- Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
- Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
- Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
- Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
- Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
- Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
- Miyawaki-Shimizu, K., et al. . Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).
