カチオン性リポソームを介した特異的siRNAの再配達によるマウスの肺におけるIntersectin-1Sの長期サイレン。電子顕微鏡によるノックダウン効果の評価
Summary
マウスでカチオンliposomes/siRNA/ITSN-1s錯体、24日間の72時間ごとの繰り返し眼窩注射は、効率75％でITSN-1 mRNAおよびタンパク質の発現を軽減マウス肺の微小血管系へのsiRNA二本鎖を提供します。この手法は、動物モデルにおいて非常に再現性がある、有害な影響を持っていないと死亡を回避することができます。
Abstract
これまでの研究では、ITSN-1S（KD ITSN）、肺血管透過性および内皮細胞の調節に関与してエンドサイトーシスタンパク質（ECS）生存、誘導されたアポトーシス細胞死、長引くITSN-1Sと細胞培養系を開発する上で大きな障害とノックダウンを示した阻害1。キャリアとしてカチオン性リポソームを使用して、我々はITSN-1遺伝子（のsiRNA ITSN）標的とするsiRNAの全身投与により、マウス肺でITSN-1遺伝子のサイレンシングを検討した。 2を生成するために、反復投与で安全非免疫原性、無毒、かつ簡単：カチオン性リポソームは、siRNAの送達のためのいくつかの利点を提供する。リポソームの性能と生物学的活性は、コレステロールおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドの組み合わせを使用してそれらのサイズ、電荷、脂質組成、安定性、用量および投与3の経路ここで、効率的で得られたマウスの肺内の特定KD ITSNに依存する。静脈内送達のsiRNA ITSNの/カチオン性リポソーム複合体は一時的にさらに3日後に回復した3日目でマウス肺におけるITSN-1Sタンパク質およびmRNAをノックダウン。再現性のある安全なキャリアとしてのカチオン性リポソームを利用して、研究では、24日間延長した。したがって、新たに生成された複合体と眼窩治療は研究4を通して持続KD ITSNを誘発、3日ごとに投与した。いくつかの時点後のsiRNA ITSNで収集されたマウス組織、肺内皮に、慢性KD ITSNの効果を評価するために電子顕微鏡（EM）分析に供した。高分解能EMイメージングは、私たちは、肺血管床でKDITSNによって生じる形態学的変化を評価することができ、光学顕微鏡によって特性が検出不能、（内皮障壁すなわち崩壊、カベオラの数と代替輸送経路のアップレギュレーションを減少させた）。全体として、これらの調査結果は重要を設立ECの機能と肺の恒常性におけるITSN-1の重要な役割、in vivoでのsiRNA-リポソームの配信の有効性を示す一方。
Introduction
裸のsiRNAは、細胞膜を透過できない負に帯電され、それは血液中の酵素、組織および細胞によって容易に分解される。さえ安定性を向上させるために、最近構造的修飾を、投与後の標的部位でのsiRNAの蓄積が極めて低く、効率的な細胞内の車両5を必要とする。カチオン性リポソームは、カプセル化酵素分解6から核酸を保護することによって、細胞へのDNA / RNAの大部分を転送する可能性のある安全な核酸キャリアとして浮上した。また、カチオン性リポソームは、自発的にこのようにセル2への遺伝子導入を推進し、DNA / RNAと相互作用する。より最近では、リポソームワクチン及び低分子量薬物7送達するために適用されている。のリポソーム送達、マイクロRNA-7発現プラスミドは、8肺癌細胞における上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤耐性を克服する。ターゲットとした場合複合体は内皮関門を通過し、間質9で浸出しにくいので、血管内皮は、静脈内送達が不可欠です。他の臓器との比較によって、肺微小血管からのECの最大吸収を有し、熱心にリンパ節およびパイエル板9に続くカチオン性リポソームおよびDNA / RNA複合体を、内在。眼窩または尾静脈注射を介したsiRNAの齧歯類モデルにおける静脈内送達は、50 mg / kgを10のような高濃度でも無害証明されています。公表された文献で は、カチオン性リポソームの組成物は、脂質製剤とそのモル比11、12に基づいて異なります。 、ワクチンや抗腫瘍療法13-15の配信をタンパク質のdown-regulation/over-expressionをターゲットにするかどうかを、in vivoでの遺伝子送達のためのカチオン性リポソームを用いた潜在的なアプリケーションの広い配列があります。覚えておくことが重要DNA / RNA-細胞膜との相互作用の効率が生成錯体、膜脂質の間のカップリングの形状によって規制されることである。これは、標的細胞膜プロファイルに脂質組成物を調整することは、特定の細胞型6にトランスフェクション率の高さに有益かつ結果であり得ることを示唆している。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は長期的には特異的なsiRNA /リポソーム複合体の反復静脈内投与（24日間連続して毎72時間、）によってin vivoで ITSN-1のノックダウンのためにこの方法を開発し、他9、私たち1、18が公表以前の研究に基づいています。この実験的なアプローチは、効率的で安全かつ繰り返し使用することができ、それは容易に肺内皮および肺ホメオスタシスにおける関心のあるタンパ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、SPへの健康補助R01HL089462研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) | Sigma-Aldrich | D2779 | |
| LiposoFast stabilizer (mini-extruder) | Avestin Inc. | LF-STB | |
| Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore | Avestin Inc. | LFM-50 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8667 | |
| Chloroform | Mallinckrodt Chemicals | 4432-04 | |
| Hank’s balanced salts | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Round-bottom flask | Fisher Scientific | FHB-275-030X | |
| Mouse siRNAITSN – on target | Dharmacon/ThermoScientific | J-046912-11 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | REGLO-CDF digital with RHOO pump head | |
| Ventilator | Hugo Sachs Electronik | NA | |
| Barbital | Sigma-Aldrich | B-0500 | |
| Uranyl acetate | EM Sciences | 22400 | |
| Epon812 | EM Sciences | Discontinued by the manufacturer | |
| Propylene oxide | EM Sciences | 20400 | |
| Embedding molds | EM Sciences | 69923-05 | |
| Tannic acid | EM Sciences | 21710 | |
| 8 nm gold-albumin tracer | Prepared in the laboratory as in16 | ||
| Comments | |||
| Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1) | |||
| Pyrex, 100 ml | |||
| Modified siRNA, in vivo | |||
| Part of IDEX corp. | |||
| D-79232 March, Germany | |||
| Replaced with Embed812, cat. # 14120 |
Riferimenti
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