La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines
Summary
Cette procédure donne des neurones télencéphaliques en passant par les points de contrôle qui sont similaires à ceux observés au cours du développement humain. Les cellules peuvent se différencier spontanément, sont exposés à des facteurs qui les poussent vers la lignée neuronale, sont isolés et sont étalées sur des lamelles couvre-objet pour permettre une différenciation terminale et de maturation.
Abstract
Ici, une procédure par étapes pour générer efficacement télencéphaliques neurones glutamatergiques de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) a été décrite. Le processus de différenciation est déclenchée par la rupture des CPP de l'homme en touffes qui complètent pour former des agrégats lorsque les cellules sont placées dans une culture en suspension. Les agrégats sont ensuite cultivées dans un milieu de CSEh jours 1-4 pour permettre une différenciation spontanée. Pendant ce temps, les cellules ont la capacité de devenir l'une des trois feuillets embryonnaires. De 5-8 jours, les cellules sont placées dans un milieu d'induction neurale pour les pousser dans la lignée neuronale. Autour jour 8, les cellules sont autorisés à fixer sur plaque de 6 puits et de se différencier au cours de laquelle la forme des cellules neuro-épithéliale. Ces cellules neuro-épithéliales peuvent être isolés au jour 17. Les cellules peuvent ensuite être conservé sous forme de neurosphères jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être étalées sur des lamelles. L'utilisation d'un milieu de base sans aucun facteur de caudalizing, les cellules neuro-épithéliales sont précisésd télencéphaliques en précurseurs, qui peuvent ensuite être davantage différenciées en progéniteurs télencéphaliques dorsales et les neurones glutamatergiques efficacement. Dans l'ensemble, notre système offre un outil pour générer des neurones glutamatergiques de l'homme pour les chercheurs d'étudier le développement de ces neurones et les maladies qui les affectent.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (CISP), ont la capacité de produire tous les types de cellules dans le corps, y compris les neurones 1-3. Différenciation dirigée des différents sous-types neuronaux du PSC de l'homme détient la clé de l'application de ces cellules en médecine régénérative. La génération des sous-types neuronaux fonctionnels au cours du développement est un processus complexe impliquant l'induction de la lignée neuronale, la spécification des progéniteurs régionales le long de l'axe rostro-caudal, et la différenciation des types de neurones post-mitotiques des progéniteurs régionaux 4,5. A partir de 2001, plusieurs systèmes ont été mis en place pour générer des lignées de CSEh neurones, qui ont fourni une plate-forme pour la génération suivante de sous-types neuronaux 6,7. Basé sur les principes de développement, les types de neurones plusieurs comme la colonne vertébrale neurones moteurs 8-12, mésencéphale dopneurones aminergiques 13-15, les cellules rétiniennes neuronales 16,17 ont été efficacement spécifié dans les CSP de l'homme. Cela a été fait en appliquant morphogènes essentiels qui sont importants pour la spécification de ces types de neurones au cours du développement in vivo. D'autres protocoles ont également été élaborées pour promouvoir la différenciation des CSEh dans les neurones en utilisant soit des facteurs supplémentaires tels que les 18-20 petites molécules ou par co-culture avec d'autres types cellulaires pour aider à promouvoir la différenciation 21.
Le néocortex humain est très développé et contient de nombreux types cellulaires, y compris les neurones glutamatergiques qui jouent un rôle important dans l'apprentissage, la mémoire et la fonction cognitive 22,23. La première étape pour générer des neurones glutamatergiques dans la culture est de spécifier des cellules progénitrices télencéphaliques. Groupe de Yoshiki Sasai le premier signalé la différenciation dirigée des précurseurs télencéphaliques de la souris CES (mESCs) en utilisant une suspensio sans sérumn culture en présence de DKK1 (qui inhibe la signalisation Wnt) ainsi que LeftyA (qui inhibe la signalisation nodal) 24. Par la suite, plusieurs groupes, dont le nôtre ont également signalé la spécification des précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme dans le sérum 25-27 milieu exempt. La génération des précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme n'exige pas l'utilisation de morphogènes exogènes et l'efficacité dans la production de ces précurseurs est beaucoup plus élevé que celui de mESCs 26,27. Ici, un système chimique définie pour l'induction neurale qui a été bien établi par le groupe de Zhang 7 a été décrite. Sans l'ajout de facteurs exogènes caudalizing, ce protocole génère efficacement les précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme 27. Ces progéniteurs peuvent alors se différencier en progéniteurs dorsales ou ventrales en régulant la signalisation de Wnt et sonic hedgehog (SHH). Les progéniteurs dorsaux peuvent en outre se différencier en neurones glutamatergiques efficiently 27. En outre, ce protocole fonctionne aussi bien pour la génération de neurones glutamatergiques de l'homme iPSCs 28, qui permet de générer des neurones spécifiques du patient qui peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme d'action ainsi que des thérapies potentielles pour un large éventail de maladies . De plus, notre système offre également une plate-forme pour explorer le développement et la spécification des divers types de neurones dans le télencéphale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il ya plusieurs étapes importantes au cours du processus de différenciation neurale. Il est important de s'assurer que les CSP sont pluripotentes humaines car, sinon, les cellules peuvent déjà être biaisée en vue de devenir une lignée non neuronales. Cela peut être confirmé par coloration des CSP de l'homme avec des anticorps contre les marqueurs de pluripotence comme Oct4, Sox2, Nanog, et Tra-1-60 1-3. Si les guichets de l'homme n'attache pas très bien après les passages, inhibiteu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Y. Sasai pour avoir généreusement fourni l'anticorps FOXG1. Ce travail a été soutenu par des subventions souches Connecticut recherche sur les cellules (08-SCB-UCHC- 022 et 11-SCB24) et la Fondation paraplégie spastique.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalog # |
| Dulbecco’s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 |
| 2-Mercaptoethanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| N2 | Gibco | 17502-048 |
| B27 | Gibco | 12587-010 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 |
| FBS | Gemini | 100-106 |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 |
| Dispase | Gibco | 17105-041 |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | |
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 |
| 15 ml tubes | BD | 352097 |
| 6 well plates | BD | 353046 |
| 24 well plates | BD | 353047 |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 |
| 9” glass pipetes | Fisher | 13-678-20D |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | |
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | |
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
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