Трехмерных изображений внутриэпидермальных ноцицептивных нервных волокон в человека биопсию кожи
Summary
С целью изучения изменений ноцицептивных внутриэпидермальных нервные волокна (IENFs) в болезненных невропатии (PN), мы разработали протоколы, которые могут непосредственно исследовать трехмерный морфологических изменений, наблюдаемых в ноцицептивных IENFs. Трехмерный анализ IENFs имеет потенциал, чтобы оценить морфологические изменения в IENF PN.
Abstract
Биопсии кожи обычно используется для количественной внутриэпидермальных нервных волокон плотностью (IENFD) для диагностики периферической 1,2 полинейропатии. В настоящее время это обычная практика, чтобы собрать 3 мм биопсии кожи от дистального ногу (DL) и проксимального бедра (PT) для оценки длины зависит полинейропатии 3. Однако из-за разнонаправленного характера IENFs, это сложно рассматривать перекрытие нервных структур путем анализа двумерного (2D) изображения. Кроме того, трехмерные (3D) изображения может обеспечить лучшее решение этой дилеммы.
В настоящем докладе мы представляем методы применения 3D визуализации для изучения болезненной нейропатии (PN). Для того чтобы определить IENFs, образцы кожи обрабатываются для иммунофлуоресцентного анализа белковых генного продукта 9,5 (PGP), поддон нейронального маркера. В настоящее время она является стандартной практикой для диагностики небольших невропатии волокна с использованием IENFD сдерживанияляется PGP иммуногистохимию использованием светлого микроскопии 4. В данном исследовании мы применяли двойного иммунофлуоресцентного анализа для определения общего IENFD, используя PGP и ноцицептивной IENF, с помощью антител, которые распознают тропомиозином-рецептор-киназы (TRK), высокое сродство к рецептору фактора роста нервов 5. Преимущества совместного окрашивания IENF с PGP и ТРК антител приносит пользу изучения PN, четко окрашивания PGP-позитивные, ноцицептивных волокон. Эти флуоресцентные сигналы могут быть количественно определить ноцицептивных IENFD и морфологические изменения, связанные с IENF PN. Флуоресцентные изображения приобретаются с помощью конфокальной микроскопии и обрабатывается для анализа 3D. 3D-визуализация обеспечивает крутящий способностей для дальнейшего анализа морфологических изменений, связанных с PN. Взятые вместе, флуоресцентные совместным окрашиванием, конфокальной микроскопии и 3D анализ ясно пользу изучения PN.
Introduction
В настоящее время это обычная практика для врачей количественно внутриэпидермальных нервного волокна плотностью (IENFD) из кожи биопсии удар, который может быть использован для диагностики небольших невропатии волокна 3, 6-8. Биопсии взяты из дистальной ножки (DL), 10 см над наружной лодыжки, и проксимальный бедра (РТ), 20 см ниже передней подвздошной ости 9. Все IENF помечены использованием белкового продукта гена 9,5 (PGP), пан нейронный маркер 10-12. В настоящее время она является стандартной практикой для диагностики небольших невропатии волокна с использованием IENFD определяется PGP окрашивания светлого микроскопии 6. Кроме того, некоторые исследовательские группы использовали иммунофлуоресцентного протоколы для PGP иммуногистохимии 7-9. Малый невропатии волокна, обычно связанных с невропатической боли. В целях более глубокого понимания роли IENF необходимых для обработки боли, мы разработали методику совместного этикетке общей IENF с волокнами, которые генерируют боли. Nocicepных IENF, в частности Aδ и С-волокна, могут быть изучены через кооперацию, маркировка IENF с PGP и ноцицептивной маркером, тропомиозином-рецептор-киназы (TRK) 5. Trk является высокое сродство к рецептору фактора роста нервов, что является необходимым для развития болевой чувствительности. ТРК-положительных ноцицептивных нервных волокон являются волокна, которые пептидергических экспресс вещество Р (SP) и кальцитонин ген родственный пептид (CGRP). Ранее Лория и коллеги применили двойной маркировки методика исследования PN, со-маркировки PGP-позитивные IENF с ноцицептивной маркером 10. В нашем предыдущем исследовании мы показали, что Trk IENF-положительных, но не Trk-отрицательных IENF, были активируется в животной модели болезненной диабетической нейропатии 5. Это сотрудничество маркировки метод обеспечивает возможность сравнить количественное ноцицептивных IENFD к общему IENFD и способность изучение морфологических изменений, связанных с PN. Возможность визуализировать ноцицептивных IENF и компаниямповторное определение количества от общего IENFD в ноцицептивных IENFD может обеспечить объективных признаков на наличие боли и, возможно представление о серьезности боль, связанную с PN. Этот метод также применим к коже животных моделях. По сравнению с предыдущими исследованиями, текущий протокол описывает методы для анализа 3D изображения, создавая возможность избежать ошибок, которые могут возникать в 2D анализа изображения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Измерение IENFD широко используется для определения степени периферические невропатии 13,14. В настоящее время наиболее часто используемый протокол только измеряет плотность нервных волокон, которые проникают через базальную мембрану эпидермиса, она не учитывает аксональное ветв?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения Гранты K08 NS061039-01A2, Программа исследований неврологии и Discovery, и Альфред Таубман А. Института медицинских исследований в Университете Мичигана. Наша работа Морфология и анализ изображений Основные научно-исследовательского Мичиган Диабет и учебный центр, финансируемый Национальным институтом здоровья Грант 5P90 DK-20572 от Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний. Авторы хотели бы поблагодарить Робинсон Синглтон и Гордон Смит (Университет штата Юта) за их щедрое пожертвование образцы кожи человека для поддержки первоначального развития ноцицептивной технику иммуногистохимию биомаркеров.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
