Separation av<em> Plasmodium falciparum</em> Sent skede-infekterade erytrocyter genom magnetiska organ
Summary
De paramagnetiska egenskaper hemozoin används för att isolera sena stadier av<em> Plasmodium falciparum</em>-Infekterade röda blodkroppar som växer i odling. Metoden är enkel och snabb och påverkar inte de efterföljande invasiva förmåga parasiterna.
Abstract
Till skillnad från andra Plasmodium-arter, P. falciparum kan odlas i laboratoriet, vilket underlättar sin studie 1. Medan parasitemi uppnåtts kan nå ≈ 40%-gränsen, håller utredaren vanligtvis andelen på runt 10%. I många fall är det nödvändigt att isolera de parasit-innehållande röda blodkroppar (RBC) från de oinfekterade sådana, att berika kulturen och fortsätt med ett givet experiment.
När P. falciparum infekterar erytrocyt, försämrar parasiten och matar från hemoglobin 2, 3. Måste dock parasiten hantera en mycket giftig järninnehållande haem del 4, 5. Parasiten undgår dess toxicitet genom att omvandla haem till en inert kristallpolymer heter haemozoin 6, 7. Denna järn-innehållande molekylen lagras i sin födovakuolen och metallen i den har en oxidativ tillstånd som skiljer sig från den i haem 8. Den trevärt tillstånd av järn i haemozoin ger det en paramagnetisk fastighet frånvarande i oinfekterade erytrocyter. Eftersom de invaderande parasiten når mognad, ökar halten av haemozoin också 9, vilket skänker ytterligare paramagnetism om de senaste stadierna av P. falciparum inuti erytrocyt.
Baserat på denna paramagnetiska egendom, de senaste stadierna av P. falciparum infekterade-röda blodkroppar kan separeras genom att låta kulturen genom en kolonn innehållande magnetiska pärlor. Dessa pärlor blir magnetisk när kolumnerna innehåller dem placeras på en magnethållare. Infekterade RBC på grund av sin paramagnetism, kommer sedan att fångas inuti kolonnen, medan genomflödet kommer att innehålla, till största delen, oinfekterade erytrocyter och de som innehåller tidiga stadier av parasiten.
Här beskriver vi den metod att anrika populationen av sent stadium parasiter med magnetiska kolonner, som upprätthåller god parasit livskraft 10.Efter att ha utfört denna procedur kan den fria kulturen returneras till en inkubator för att återstående parasiter att fortsätta växa.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro kulturer av malariaparasiten P. falciparum uppvisar en begränsad parasitemi, med mer än hälften av de röda blodkropparna oinfekterade på den högsta spridning punkt kultur. För de flesta forskningsområden experiment, är det önskvärt att endast arbeta med de infekterade erytrocyter. För detta ändamål är en separationsteknik nödvändigt att dela kulturen enligt infektion. Användbara metoder innefattar användningen av streptolysin O att permeabilisera och Lyze de oinfekterade RBC…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av bidrag PRB-009 till CS och en doktorsexamen stipendium till LC, från Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
Riferimenti
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J. Haemozoin formation. Mol. Biochem. Parasitol. 157 (2), 127-136 (2008).
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
