分离<em>恶性疟原虫</em>晚期感染的红细胞由磁性装置
Summary
顺磁性质的疟原虫色素是用来隔离后期阶段<em>恶性疟原虫</em>感染的红血细胞在培养皿中生长。该方法简单，快速，不影响后续的寄生虫的侵袭能力。
Abstract
与其他种类的疟原虫，P.恶性疟原虫可以在实验室中培养，这有利于研究1。虽然原虫能够达到≈40％的限制，研究者通常的比例保持在10％左右。在许多情况下，它是必要的隔离含寄生虫的红血细胞（红细胞）来自未感染的，以丰富的文化和继续进行，一个给定的实验。
当P.恶性疟原虫感染的红细胞，寄生虫降解和，馈送来自血红蛋白的2，3。然而，寄生虫必须处理的一个非常有毒的含铁血红素部分4，5。寄生虫逃避其毒性称为haemozoin 6，7成惰性液晶聚合物通过转化的血红素。此含铁分子被存储在其食物泡和在它的金属有一个从一个在血红素8中不同的氧化状态。血红素铁的铁状态ozoin赋予它在未受感染的红细胞没有一个顺磁性。作为入侵的寄生虫成熟，的haemozoin含量也增加9，赋予更顺磁性的 P上的最新的阶段恶性疟原虫红细胞内。
基于此顺磁性，最新的阶段P.恶性疟原虫感染的红血细胞可通过一列含有磁珠通过培养分离。这些珠粒成为磁性的磁体保持器时，被放置在含有它们的列。感染的红细胞，由于其顺磁性，然后将被媚惑列，而将包含流过，在大多数情况下，未感染的红细胞和那些含有早期阶段的寄生虫。
在这里，我们描述的方法，以丰富的人口后期寄生虫与的磁性列，保持着良好的寄生虫可行性10。在执行此过程，独立的文化可以返回一个孵化器，让剩余的寄生虫将继续增长。
Protocol
所有步骤的协议，除了离心，应进行发动机罩内保持无菌样品。 1。后期分离P.恶性疟原虫感染的红细胞疟原虫感染的红细胞的所有阶段的后期，可以用这种方法，分离自疟原虫色素，赋予对寄生虫的顺磁性，是一种常见的代谢物的属。甲高原虫（3-10％），建议在培养以获得更好的产率与该协议，虽然典型的培养将包含2-4％的血细胞比容（体积的红?…
Representative Results
在图2中，示出的磁性列通过培养之前，（A）和（B）后的程序。一到两个感染的红细胞通常出现在一个放大100倍的字段，如在图2中所示，在图2A中的感染的红细胞上，箭头指向。在一个典型的过程中，在5％的寄生虫血症（ 图2A）与培养开始时，此过程的性能，通常会产生红细胞与原虫的97％-100％（ 图2B）。?…
Discussion
在体外培养的疟疾寄生虫P.疟原虫表现出有限的原虫，超过一半的未感染的红血细胞，在最高的增殖培养点。对于大多数的研究实验中，它是理想的工作只与感染的红细胞。为此，一个分离的技术是必要的划分所述培养感染。有用的方法包括使用的链球菌溶血素O，以透性和lyze的未感染RBC 11和一系列利用两组不同密度的变化的差离心。这些方法的一些包括明胶浮选12?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由授予PRB-009，CS，博士生奖学金，LC，从国家的秘书CIENCIAŸTECNOLOGIA（SENACYT），巴拿马。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
Riferimenti
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J. Haemozoin formation. Mol. Biochem. Parasitol. 157 (2), 127-136 (2008).
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
Citazione di questo articolo
Coronado, L. M., Tayler, N. M., Correa, R., Giovani, R. M., Spadafora, C. Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means. J. Vis. Exp. (73), e50342, doi:10.3791/50342 (2013).