Assemblage van Nucleosomale Arrays van Recombinant kernhistonen en Nucleosome Positioning DNA

Summary

Een methode wordt gepresenteerd voor de reconstructie van model nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde nucleosoom positionering DNA. We beschrijven ook hoe sedimentatiesnelheid experimenten analytische ultracentrifuge en atomic force microscopie (AFM) worden gebruikt voor het monitoren van de mate van nucleosomale matrix verzadiging na reconstitutie.

Abstract

Kern histon octameren die herhaaldelijk zijn verdeeld langs een DNA-molecuul worden genoemd nucleosomale arrays. Nucleosomale arrays worden verkregen op twee manieren: zuivering uit in vivo bronnen of reconstitutie in vitro van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde positionering nucleosoom DNA. Deze methode heeft het voordeel dat voor de montage van een qua samenstelling uniform en nauwkeurig gepositioneerd nucleosomale array. Sedimentatiesnelheid experimenten in de analytische ultracentrifuge opbrengst informaties grootte en vorm van macromoleculen door analyse van de snelheid waarmee ze migreren door oplossing onder centrifugale kracht. Deze techniek, samen met atomic force microscopie kan worden gebruikt voor kwaliteitscontrole, zodat de meerderheid van DNA-matrijzen verzadigd met nucleosomen na reconstitutie. Hier beschrijven we de protocollen noodzakelijk milligram hoeveelheden lengte reconstitueren en compositioneel defined nucleosomale arrays geschikt voor biochemische en biofysische studies van chromatine structuur en functie.

Introduction

Eukaryote genomen niet bestaan ​​als naakt DNA, maar eerder worden samengeperst en georganiseerd door gebonden eiwitten. Deze complexen van DNA en eiwitten bekend als chromatine. De basis repeterende eenheid van chromatine is de nucleosoom. Een nucleosoom bestaat uit histon octameer en 146 basenparen van het DNA rond de histon octameer ongeveer 1,6 keer ^1. De histon octameer bestaat uit twee exemplaren elke kern histonen H2A, H2B, H3 en H4. Kern histon octameren die herhaaldelijk zijn verdeeld langs een DNA-molecuul worden genoemd nucleosomale arrays. De uitgebreide structuur van nucleosomale arrays is aangeduid als 10 nm vezel of "kralen aan een snoer" structuur aanwezig in vitro onder lage zoutconcentraties ^2. De 10 nm vezel is in staat om condensatie in hogere orde structuren door intra-reeks verdichting en / of inter-array-oligomerizatie ^2. Deze hogere orde structuren kunnen worden geïnduceerd in aanwezigheid van zouten,of kan worden beïnvloed door de binding van chromatine architectonische eiwitten aan de nucleosomale matrix ^3,4. Niveaus van chromatine verdichting worden omgekeerd gecorreleerd met de snelheid van transcriptie in vivo ^5,6. Recent onderzoek wijst op het belang van de structurele organisatie van genomen in processen zoals differentiatie, de ontwikkeling van kanker, en anderen ^7,8. Het gebruik van nucleosomale arrays chromatinestructuur en functie te bestuderen is wijdverspreid. Hier beschrijven we een werkwijze voor de assemblage van nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en nucleosoom positionering DNA.

Met behulp van recombinant DNA met tandem herhalingen van nucleosoom positionering sequenties maakt de reconstitutie van arrays die regelmatige afstand nucleosomen bevatten. Twee van de meer populaire positionering sequenties 5S rRNA gensequentie en de "601"-sequentie ^9,10. De 601 serie werd afgeleid van SELEX experimenten en more sterker positioneert nucleosomen dan de 5S-sequentie ^11. Bijgevolg linker DNA lengte van de arrays 601 is homogener. Tandem herhaalde DNA nucleosoom positionering wordt verkregen door gelfiltratie ^4,12. Recombinant histonen gezuiverd uit E. coli onder denaturerende omstandigheden ^13. Het gebruik van recombinante histonen kan men de histon samenstelling van de nucleosomale arrays zorgvuldig controleren. Bijvoorbeeld, kernhistonen dragende specifieke mutaties ¹⁴ of post-translationele modificaties ^15,16 kan worden vervangen voor wild type kernhistonen.

Sedimentatiesnelheid experimenten toezien op de snelheid van sedimentatie van macromoleculen in oplossing onder een toegepaste middelpuntvliedende kracht ^17. Deze geeft informatie over de grootte en de vorm van macromoleculen in een monster. Sedimentatiesnelheid experimenten zijn dus een geschikt instrument voor het bestuderen oplossing staat veranderingen in chromatine vezelstructuur als gevolg van chromatinecondensatie ^18. Belangrijker is, is het eerst nodig om sedimentatiesnelheid experimenten gebruiken als een kwaliteitscontrole stap in nucleosomale reeks reconstitutie. Als DNA en nucleosomen niet worden gecombineerd bij de juiste molaire verhouding, kan de arrays onder-of oververzadigd met kernhistonen. Aldus wordt de informatie uit sedimentatiesnelheid experimenten om te verzekeren dat de juiste DNA verzadigd met nucleosomen. Het is belangrijk om alternatieve methoden voor het schatten van de verzadiging van DNA met nucleosomen, vooral als die met een eerder niet gekenmerkte DNA template. Daarom hebben we ook een werkwijze beschreven voor het analyseren van nucleosomale arrays met behulp van atomic force microscopie (AFM). AFM is een techniek die het mogelijk maakt visualisatie van de effecten van een aantal parameters, zoals de mate van verzadiging, effect van de aanwezigheid van histon varianten of de effecten van _MgCl2 ^19,20. AFM heeft ook toepassing geweested aan nucleosomen bestuderen met behulp van time lapse imaging ^21. In vitro gemonteerd nucleosomale 12-meer arrays zijn bijzonder vatbaar voor AFM onderzoeken omdat zij behoren in de juiste maat bereik voor AFM beeldvorming ^22. In de huidige studie hebben we gebruik gemaakt van de AFM nucleosomale arrays als kwaliteitscontrole, evenals een middel van het bevestigen van de gegevens van AUC ("zien is geloven"). Naast eenvoudige visualisatie, AFM kan gemeten hoogteprofielen monsters als extra metrisch.

Protocol

1. Assemblage van Recombinant kernhistonen in octameren Achtergrond: De eerste stap in nucleosomale scala reconstitutie is om inheemse kern histon octameren uit gevriesdroogde recombinant kernhistonen bereiden. Histon-eiwitten worden gecombineerd in gelijke molaire hoeveelheden en in histon octameren samengesteld door dialyseren de monsters uit een denaturerende buffer in hervouwingsbuffer. Zuiver en lyofiliseren recombinant kernhistonen (H2A, H2B, H3, H4) beschreven 13.</sup…

Representative Results

Om het protocol te illustreren we gereconstitueerde nucleosomale arrays uit recombinante Xenopus kernhistonen en DNA bestaande uit 12 tandem 207 bp herhalingen van de 601 positionering reeks (601 207 x 12). We hebben eerst geassembleerd inheemse octameren uit gevriesdroogde kernhistonen en vervolgens gezuiverd de octameren door FPLC met een S200-kolom (Figuur 1A). Grotere complexen eerder elueren uit de kolom S200. Histonen algemeen elueren in deze volgorde: niet-specifieke histon ag…

Discussion

Model nucleosomale arrays zijn een zeer nuttig instrument voor de in vitro studie van chromatine structuur en functie. Zo zijn ze veel gebruikt om het mechanisme van chromatine condensatie vezels bestuderen oplossing ^30-34, en maakte het mogelijk een röntgenstraal structuur van een tetranucleosome ³⁵ verkrijgen. Meer recent hebben ze nuttig zijn in het ontcijferen van de structurele effecten van specifieke kern histon-varianten, mutanten en posttranslationele modificaties ^{14-16,36</s…}

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge	Beckman-Coulter