A Novel<em> Ex vivo</em> Kultur Fremgangsmåde til Embryonale Mouse Heart

Summary

Udviklingsmæssige studier i mus er hæmmet af den manglende adgang til embryo under svangerskabet. At fremme den langsigtede kultur embryonale hjerte på sene stadier af drægtighed, udviklede vi en protokol, hvor det udskårne hjerte dyrkes i en halvfast, fortyndet Matrigel.

Abstract

Udviklingsmæssige studier i mus er hæmmet af den manglende adgang til embryo under svangerskabet. Således, at protokoller isolere og kultur enkelte organer af interesse er afgørende for at tilvejebringe en metode til både visualisering ændringer i udviklingen og giver nye behandlingsstrategier. At fremme den langsigtede kultur embryonale hjerte på sene stadier af drægtighed, udviklede vi en protokol, hvor det udskårne hjerte dyrkes i en halvfast, fortyndet Matrigel. Dette substrat giver tilstrækkelig støtte til at opretholde den tredimensionale struktur, men er fleksibel nok til at tillade fortsat sammentrækning. Kort fortalt er hjerter udskåret fra embryoner og anbringes i en blanding af kold Matrigel fortyndet 1:1 med vækstmedium. Efter den fortyndede Matrigel størkner, er vækstmedium tilsættes til kulturen skålen. Hearts udskåret så sent som embryonale dag 16.5 var levedygtige i fire dage efter dissektion. Analyse af koronar plexus viser, at denne metode ikkeforstyrre koronar vaskulær udvikling. Således præsenterer vi en hidtil ukendt fremgangsmåde til langvarig kultur af embryonale hjerter.

Introduction

I de seneste år har den transgene mus været den altovervejende modelsystem til at studere udviklingen hjertefejl. Imidlertid har andre modelorganismer, såsom zebrafisk, vist sig at have betydelige fordele i forhold til mus. Tre store fordele ved zebrafisk er den eksterne udlægning af æg, for at lette adgangen til de embryoner, den optisk transparens af embryonerne, der giver let visualisering af hjertets udvikling, og den lethed for at anvende små molekylære behandlinger til at modulere udviklingen af ​​embryo ^1.. Således vil udviklingen af ​​en kultur teknik, der tillod ex utero vækst af en embryonisk organ bypass, i det mindste delvist, i øjeblikket de begrænsninger opleves af forskere studerer udviklingsprocesser i transgene mus.

Ex vivo kardielle kultur systemer er blevet udviklet i både kylling og museembryo der tillader behandling med små molekyler og analyse af hvordan DIFskellige områder af hjertet kommunikere ^2-6. For hele mus hjerte kultur, taget hjerter fra fostre op til embryonale (E) 12.5 alder kan placeres i dyrkningsmedium med eller uden rokkende ^2,3,5. Ved hjælp af denne teknik, er embryonale hjerter blevet inkuberet med ækvivalente E13.5 og hjerter dyrket med vuggende blevet opretholdt, så længe tre dage (starter ved E10.5) ^3.. Imidlertid har ingen undersøgelser rapporteret en vellykket kultur af hjerter fra ældre embryoner. Ligeledes er rednings forsøg været begrænset til anvendelsen af det terapeutiske middel globalt til dyrkningsmediet ^2..

Et udsnit kultur system, hvor hjerterne udskæres, indlejret og snit med en vibratome, er også blevet anvendt til både yngre hjerter, såsom E12.5 mus hjerter og Hamburger-Hamilton stage 36 (ca. E16 i mus) chick hjerter ^2,4,6, og ældre hjerter, såsom post-natal og voksne mus hearts og voksne menneskelige hjerter ^7,8. Mens embryonale analyser typisk har udnyttet 150-um tykke sektioner ^2,4 kan snittykkelsen være en stor som 500 um uden tegn på iltmangel ^8.. Disse skivekulturer er blevet opretholdt så længe som to måneder i kultur med de fleste skiver opretholdelse kontraktilitet i hele denne periode ^9.. Forhold til undersøgelser på isolerede cardiomyocytter giver disse skivekulturer co-kultur af cardiomyocytter med deres tilstødende celletyper og give en nyttig metode til ex vivo-analyse. Men disse kulturer kræver mere omfattende opsætning end blot at placere et hjerte i dyrkningsmedium (fx indlejring levende hjerte for sektionering på en vibratome), og enhver analyse er naturligvis begrænset til den del af hjertet i den sektion.

I betragtning af de begrænsninger, der er beskrevet ovenfor til dyrkning embryonale mus hjerter og det væld af transgene mus available til undersøgelse, har vi udviklet en ex vivo mus hjerte kultur system svarende til en ex vivo lunge kultur udviklet af Weaver, et al. ^10. Vores kultur system giver langvarig kultur og visualisering af ombygningen koronar omsætning i hele embryonale mus hjerter. Desuden giver brugen af ​​Matrigel perler at blive holdt på plads nær hjertet, hvilket giver en lokalbehandling med terapeutiske midler. Disse eksperimenter kan udføres på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter at sammenligne effekten af ​​en given behandling på en proces, såsom koronar dannelse. Fordi små molekyler kan diffundere gennem Matrigel, kan denne kultur systemet også bruges til kultur dissekerede områder af hjertet nær hinanden for at afgøre, hvorvidt specifikke celle-celle-kontakter er nødvendige for visse udviklingsprocesser eller om parakrine signalering fra en region til den anden er nødvendigt.

Dette dyrkningssystemer relativt enkel og i modsætning til skive kultur-system, der gør brug af de grundlæggende kultur reagenser og set-ups, som er let tilgængelige i de fleste laboratorier. Kort fortalt er udskåret embryonale hjerter dyrket i fortyndet Matrigel, hvilket giver et halvfast støtte. Denne støtte er tilstrækkelig til at opretholde den tredimensionale morfologi af hjertet samtidig mulighed for hjertet til at trække. Med dette system kan hele hjerter fra ældre mus embryoner (E14.5-E16.5) opretholdes i kultur i op til fire dage. Hele koronar plexus opretholdes, i modsætning til de skivekulturer, så enhver signalering tidskoder, der opstår fra forskellige regioner i hjertet være til stede. Endvidere kan levende celle fluorescerende farvestoffer permeat Matrigel at tillade visualisering af levende hjerte, og protein-konjugerede perler kan placeres nær hjertet for at tilvejebringe en lokal signalering kilde. Tilsammen udgør disse fordele gør denne teknik en ideel metode til at studere udviklingsprocesser i embryonic mus hjerte.

Protocol

1.. Udtagelse den embryonale Hearts Aflive en tidsbestemt gravid musen på den ønskede embryonale dag ved hjælp af en godkendt eutanasi teknik. Alle forsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug udvalg ved University of North Carolina i Chapel Hill. Liberalt sprøjte kvinde med 70% ethanol før dissektion. Åbn den kvindelige bughulen hente og punktafgifter uterushornet. Placer uterushornet i en petriskål indeholdende kold 1x phosphatpufret saltvand (PBS) og skylles efter b…

Representative Results

Med denne teknik, hjertet fastholder sin tredimensionale morfologi og forbliver levedygtige, som indikeret ved fortsatte sammentrækninger (film 1). Disse sammentrækninger er konsekvent mere fremtrædende i hjertets forkamre end i hjertekamrene. Efter kultur, kan hjerterne fastsættes og behandles til enten immunohistokemi eller histologi at undersøge specifik markør udtryk eller strukturer. Figur 1A viser bunden af hjertekamrene og store arterier ved en embryonale mus hjerte, der bl…

Discussion

Den nuværende kultur-systemet indebærer betydelige fordele for embryonale mus hjerte studier. Dette dyrkningssystem bevarer myokardial kontraktilitet og koronar plexus med begrænsede tegn på nekrose, selv efter fire dage i kultur. Endvidere halvfaste matrice giver tilstrækkelig støtte til at opretholde den tredimensionale morfologi udvikle hjerte samtidig giver fleksibilitet til kontrakt og også at holde coatede perler på plads under kultur. Trods denne støtte, er denne matrix permeabel for fluorescerende farve…

Materials

			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Growth factor-reduced Matrigel	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
24-well culture plate	Fisher Scientific	07-200-84
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110