A Novel<em> Ex vivo</em> Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón
Summary
Los estudios de desarrollo en el ratón se ven obstaculizados por la falta de acceso al embrión durante la gestación. Para promover la cultura a largo plazo del corazón embrionario en las últimas etapas de gestación, se desarrolló un protocolo en el que el corazón extirpado se cultiva en un semi-sólido, Matrigel diluido.
Abstract
Los estudios de desarrollo en el ratón se ven obstaculizados por la falta de acceso al embrión durante la gestación. Por lo tanto, los protocolos para aislar y cultivo de órganos individuales de interés son esenciales para proporcionar un método de visualización de los dos cambios en el desarrollo y permitiendo nuevas estrategias de tratamiento. Para promover la cultura a largo plazo del corazón embrionario en las últimas etapas de gestación, se desarrolló un protocolo en el que el corazón extirpado se cultiva en un semi-sólido, Matrigel diluido. Este sustrato proporciona apoyo suficiente para mantener la estructura tridimensional, pero es lo suficientemente flexible para permitir la contracción continua. En breve, los corazones se escinden a partir del embrión y se colocaron en una mezcla de Matrigel frío diluido 1:1 con medio de crecimiento. Después de la Matrigel diluido se solidifica, se añade medio de cultivo a la placa de cultivo. Corazones extirpados tan tarde como el día embrionario 16,5 eran viables durante cuatro días después de la disección. Análisis del plexo coronaria demuestra que este método no haceinterrumpir el desarrollo vascular coronaria. Por lo tanto, se presenta un nuevo método para el cultivo a largo plazo de los corazones embrionarias.
Introduction
En los últimos años, el ratón transgénico ha sido el sistema de modelo predominante para el estudio de defectos cardíacos de desarrollo. Sin embargo, otros organismos modelo, tales como el pez cebra, han demostrado tener ventajas significativas sobre el ratón. Tres principales ventajas de la pez cebra son la colocación externa de los huevos, para la facilidad de acceso a los embriones; la transparencia óptica de los embriones, lo que permite una fácil visualización del desarrollo cardíaco, y la facilidad de la aplicación de tratamientos moleculares pequeños para modular el desarrollo del embrión 1. Por lo tanto, el desarrollo de una técnica de cultivo que permitió el crecimiento ex útero de un órgano embrionario pasaría por alto, al menos en parte, las limitaciones actualmente experimentadas por los investigadores que estudian los procesos de desarrollo en ratones transgénicos.
Sistemas de cultivo cardíacos ex vivo se han desarrollado en tanto que el polluelo y embrión de ratón que permiten el tratamiento con pequeñas moléculas y análisis de cómo las diferentesrentes regiones del corazón comunican 2-6. Para el conjunto de la cultura corazón de ratón, corazones tomadas de embriones hasta embrionario (E) 12,5 de edad se puede colocar en medio de cultivo con o sin balanceo 2,3,5. Usando esta técnica, corazones embrionarias se han incubado con éxito a la equivalencia de E13.5, y corazones cultivadas con balanceo se han mantenido tanto tiempo como tres días (a partir de E10.5) 3. Sin embargo, no hay estudios han informado de la cultura éxito de los corazones de los embriones más viejos. Del mismo modo, los experimentos de rescate se han limitado a la aplicación del agente terapéutico a nivel mundial para el medio de cultivo 2.
Un sistema de cultivo de cortes, en el que se extirparon los corazones, incrustados, y se seccionaron utilizando un vibratomo, también se ha utilizado para ambos corazones más pequeños, tales como corazones de ratón E12.5 y Hamburger-Hamilton etapa 36 (aproximadamente E16 en el ratón) de pollo corazones 2,4,6, y más corazones, como postnatal y adulto del ratón hearts y corazones humanos adultos 7,8. Si bien los análisis embrionarias han utilizado típicamente secciones gruesas de 150 micras 2,4, espesor de corte puede ser un gran hasta 500 micras, sin evidencia de la falta de oxígeno 8. Estos cultivos de corte se han mantenido hasta dos meses en la cultura, con la mayoría de las rebanadas mantener la contractilidad durante todo este período 9. En comparación con estudios en cardiomiocitos aislados, estos cultivos de cortes permiten que el co-cultivo de cardiomiocitos con sus tipos de células vecinas y proporcionan un método útil para el análisis ex vivo. Sin embargo, estos cultivos requieren más elaborado configuración que simplemente colocar un corazón en el medio de cultivo (por ejemplo, incrustar el corazón vivo para seccionar en un vibratome), y cualquier análisis es, obviamente, limitado a la porción del corazón dentro de la sección.
Dadas las limitaciones descritas anteriormente para el cultivo de embriones de ratón de los corazones y la riqueza de los ratones transgénicos available para estudio, hemos desarrollado un ratón sistema de cultivo ex vivo de corazón similar a un sistema de cultivo ex vivo de pulmón desarrollado por Weaver, et al. 10 Nuestro sistema de cultivo permite cultivo a largo plazo y la visualización de la circulación coronaria remodelación dentro de corazones enteros embrionarias de ratón. Además, el uso de perlas de Matrigel permite que se mantienen en su lugar cerca del corazón, proporcionando de este modo un tratamiento localizado con agentes terapéuticos. Estos experimentos se pueden realizar en diferentes puntos de tiempo de desarrollo para comparar el efecto de un tratamiento dado en un proceso tal como la formación de la arteria coronaria. Debido a que las pequeñas moléculas pueden difundir a través de Matrigel, este sistema de cultivo también se puede utilizar para cultivo de regiones disecadas del corazón cerca unos de otros para determinar si los contactos célula-célula específicos son necesarios para ciertos procesos de desarrollo o si la señalización paracrina de una región a la otra es necesario.
Este sistema de cultivoes relativamente simple y, a diferencia del sistema de cultivo de cortes, hace uso de los reactivos de cultivo básicas y configuraciones que son fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios. En breve, los corazones embrionarios extirpados se cultivan en Matrigel diluido, que proporciona un soporte semisólido. Este apoyo es suficiente para mantener la morfología tridimensional del corazón mientras que también permite la contracción del corazón. El uso de este sistema, corazones enteros de embriones de ratón E14.5 (mayores-E16.5) se pueden mantener en cultivo durante hasta cuatro días. El plexo coronaria entera se mantiene, a diferencia de los cultivos de cortes, por lo que cualquier señales de señalización que se producen a partir de diferentes regiones del corazón siguen presentes. Además, los tintes fluorescentes de células en vivo pueden permear el Matrigel para permitir la visualización del corazón vivo, y perlas de proteína-conjugados se pueden colocar cerca del corazón para proporcionar una fuente localizada de señalización. En conjunto, estas ventajas hacen de esta técnica un método ideal para el estudio de los procesos de desarrollo en el embriónic corazón de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema de cultivo actual plantea importantes ventajas para estudios cardíacos embrionarios de ratón. Este sistema de cultivo conserva la contractilidad miocárdica y el plexo coronaria, con signos de necrosis limitadas, incluso después de cuatro días en cultivo. Además, la matriz semisólida proporciona el apoyo suficiente para mantener la morfología tridimensional del corazón en desarrollo al tiempo que permite flexibilidad para contrato y también para mantener perlas recubiertas en su lugar durante el cult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Andrea Portbury para la lectura crítica del manuscrito y el NIH (subvención # R01HL061656) de apoyo financiero.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. . Cardiac Development. , (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
