Мультиплексированную Люциферазы скрининга на основе Платформы Допрос связанных с раком передачи сигнала в культуре клеток
Summary
Достижение понимания систем уровня клеточных процессов является целью современной клеточной биологии. Мы описываем здесь стратегий для мультиплексирования люциферазе журналистам различных клеточных функций конечными точками, чтобы допросить использованием функции гена генома РНК-интерференции масштабе библиотек.
Abstract
Геном масштаба допроса функции гена использованием РНК-интерференции (РНК-интерференции) обещают стать для быстрой идентификации химически послушный уязвимостей раковой клетки. Ограничение потенциал этой технологии является невозможность быстро очертить механистической основе фенотипических результаты и таким образом учтены при разработке молекулярно целевых терапевтических стратегий. Мы выделяем здесь методы деконструировать сотовой фенотипа индуцированных РНК-интерференции-опосредованного генного таргетинга использованием мультиплексированных репортер системы, которые позволяют мониторинг основных раковых клеток-связанные с ним процессы. Это высокое содержание методологии скрининга является универсальным и может быть легко адаптирована для скрининга других типов больших молекулярных библиотек.
Introduction
Разнообразие люциферазы на основе репортеров для мониторинга разнообразных клеточных биологических процессов являются коммерчески доступными. Большинство из этих конструкций ДНК, кодирующих люциферазы белки, которые индуцируют экспрессию на специфические стимулы клетки или возмущений. Самые надежные транскрипционно основе репортеров поместить выражение фермента люциферазы под контролем синтетического элементов или энхансер промотора гена областей хорошо установленных для их надежности в сообщении об физиологически значимых транскрипционный 1,2 события. Есть также транс-репортер люциферазы системы, которые используют GAL4-UAS ездить экспрессию люциферазы белка. Gal4 является дрожжевая активатора транскрипции и UAS представляет собой усилитель с Gal4 который специфически связывается с активируют транскрипцию последовательности гена размещенный ниже по течению от него 3. Эти типы люциферазы системы, как правило, поддерживают две плазмиды ДНК – один кодирует белок GAL4, слитый с регулирующимры часть белка, представляющего интерес, а второй кодирует протеин люциферазы под контролем одного или нескольких UAS последовательностей. Таким образом, сотовый люциферазы сигнала отражает уровень активности белка. Другой способ использования люциферазы на основе репортеров для контроля стабильности белка посредством чего интерес белок, слитый с фермента люциферазы 4. Независимо от типа репортером, пусть покупатель будет бдителен отмечается здесь как никто не может предположить специфику любого репортера, чтобы были хорошо допросили. Таким образом, должной осмотрительности требуется внедрение новых конструкций репортер в любой стратегии исследования.
Выбор фермента люциферазы считывания может быть столь же важным, как надежность элементы ДНК, которые контролируют его выражения. В то время как люциферазы светлячка (Флорида) является наиболее широко используемый фермент в коммерчески доступных конструкций, появление новых систем репортер люциферазы, которые не требуют АТФ (как в случаеФЗ на основе реакции) или которые включают более стабильной ферменты, которые излучают сильные сигналы обещают улучшить эффективность и надежность этой исследовательской платформы. Важное замечание по выбору люциферазе журналистам в химических исследований является восприимчивость к химическим FL торможения, что может привести к ложных сообщений. По нашему опыту, другие ферменты, такие как Renilla или Gaussia люциферазы (RL и GL, соответственно), которые используют коэлентеразин качестве субстрата менее легко подавляется малых молекул 5.
Наиболее общий формат для мультиплексирования люциферазы чтения выходы влечет за собой использование ПЛС и ОЛС в значительной степени учитывая наличие простого в использовании наборов с возможностью последовательного измерения ферментативной активности из одного образца. В большинстве наборов, образцы первого воздействию люциферин выявить уровни FL активность последующей закалкой реагент, который одновременно хранение целентеразин с образованием вторичныхДары RL сигнала. С добавлением других люциферазы, которые могут быть секретируемых таких как GL или что использование еще одной подложке, такой как Cypridina люциферазы (CL), большее количество возможностей для генерации данных с высоким содержанием использованием люциферазы появились. Примером генома РНК-интерференции экране с помощью этой техники можно найти здесь 6. Этот технологический прогресс, в свою очередь стимулировало развитие конкретных механизмов, чтобы утолить каждого типа фермента люциферазы, чтобы ограничить перекрестное 7. В наших руках, мы отмечаем большую частоту "краевых эффектов" (необъяснимое тенденции в клеточной активности, связанный с краю пластины высокой культуры титр) с выделяемый люцифераз таких как GL или CL. С другой стороны, такие секретируемые люциферазы полезны для кинетического анализа, поскольку они позволяют выборки сигнала без фальсификации жизнеспособности клеток.
Для нашего исследования, представленные здесь, мы будем одновременно контролировать активность трех рак соответствующихклеточные процессы: p53, Крас и Wnt пути передачи сигнала. Журналистам включены в нашем исследовании РР53-TA-Люк FL репортер из Clontech (далее называемый p53-ФЗ репортер) 8, Elk1-GAL4/UAS-CL системы репортер (далее Elk-1 репортера; Agilent), и 8-кратным ФТС RL репортеру, что включает в себя несколько синтетических элементов усилителя признан Wnt пути транскрипционных регуляторов известный как Т-клеточного фактора (или TCFs) 9-11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько поставщиков люциферазы системы на основе репортера (например, Promega, целеуказания, New England Biolabs и Thermo Fisher), которые обеспечивают полезные он-лайн ресурсы для тех, развлекательные высокой пропускной экране в первый раз. Кроме того, множество отличных отзывов относительно опт…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем финансовой поддержке CPRIT (RP100119) и Фонд Уэлч (I-1665).
Materials
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 |
Riferimenti
- Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
- Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
- Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
- Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
- Lum, L. D., Kulak, O. Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. , (2012).
- Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
- DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
- . Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. , (2012).
- Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4 (2009).
- Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
- Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66 (2006).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338 (2011).
