Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu
Summary
Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.
Abstract
RNA girişim (RNAi) kullanılarak gen fonksiyonu Genom çaplı sorgulama kimyasal uysal kanser hücresi güvenlik açıklarının hızlı bir şekilde tespit için büyük umut vaat ediyor. Bu teknolojinin potansiyel sınırlandırılması hızla fenotipik sonuçlarının mekanik olarak tasvir ve böylece moleküler olarak hedeflenmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesi bilgilendirmek için yetersizliğidir. Biz anahtar kanser hücresi ile ilişkili süreçlerin izlenmesi izin multipleks muhabiri sistemlerini kullanarak hedef RNAi-aracılı gen tarafından uyarılan hücre fenotipleri yapısızlaştırmak burada yöntemleri özetlemektedir. Bu yüksek içerik tarama metodolojisi yönlüdür ve kolaylıkla büyük molekül kütüphaneleri diğer türlerine taranması için adapte edilebilir.
Introduction
Hücre biyolojik süreçlerin çeşitli bir dizi izlenmesi için lusiferaz tabanlı muhabir çeşitli ticari olarak temin edilebilir. Bu DNA çoğunluğu belirli bir hücre ya da uyarana tedirginlikler ile ifade etmek uyarılan lusiferaz proteinleri kodlayan oluşturur. En güçlü transkripsiyonel tabanlı muhabir sentetik güçlendirici elemanlar veya gen promotör bölgeleri, fizyolojik olarak uygun transkripsiyonel etkinliği 1,2 raporlama, güvenilirlikleri iyi kurulmuş bölgesinin kontrolü altında bir lusiferaz enzimi ifade yerleştirin. Lusiferaz protein ekspresyonunu yürütmek için GAL4 UAS kullanmaktadır trans-lusiferaz raportör sistemler de vardır. Gal4, bir maya transkripsiyon aktivatörü ve UAS Gal4 özel olarak 3 aşağı akım yerleştirilmiş gen dizilerinin transkripsiyonunu aktif hale getirmek için bağlandığı bir arttırıcı. Lusiferaz Bu tip sistemler genellikle iki DNA plazmid tarafından desteklenen – bir regulato kaynaşık GAL4 proteini kodlayanRY ilgi bir proteinin bir kısmı ve ikinci bir veya daha fazla UAS sekanslarının kontrolü altında bir lusiferaz proteinini kodlar. Bu nedenle, hücresel sinyal lusiferaz ilgilenilen proteinin aktivite düzeyini yansıtır. Lusiferaz bazlı muhabir diğer bir yaygın kullanımı ilgi bir protein, bir lusiferaz enzim 4 kaynaşmış sayede protein stabilitesi izlenmesi içindir. Bir de sorguya olduğu herhangi bir muhabiri özgüllüğünü kabul edemeyiz gibi ne olursa olsun muhabiri türü, bir sorumluluğun alıcıya ait olması burada olduğunu kaydetti. Böylece, durum tespiti herhangi bir araştırma stratejisinde yeni muhabiri yapıları dahil edilmesi gereklidir.
Lusiferaz enzim salt üzerinden seçimi ifadesini kontrol eden DNA elemanlarının güvenilirliği kadar önemli olabilir. Ateşböceği lusiferaz (FL), ticari olarak mevcut yapıları en yaygın olarak kullanılan bir enzim olan ise, (durumunda olduğu gibi ATP gerektirmeyen yeni bir lusiferaz haberci sistemleri gelişineFL-tabanlı reaksiyonlar) ya da bu araştırma platformu verimini ve güvenilirliğini artırmak için söz veriyorum güçlü sinyaller yayarlar daha istikrarlı enzimler dahil. Kimyasal çalışmalarda lusiferaz gazetecilere seçimi ile ilgili önemli bir not sahte raporlar neden olabilir kimyasal inhibisyonu FL duyarlılık olduğunu. Deneyimlerimiz, bir substrat olarak coelenterazine kullanmak gibi Renilla veya Gaussia lusiferaz (sırasıyla RL ve GL,) gibi diğer enzimler daha az kolay küçük moleküller 5 ile inhibe bulunmaktadır.
Çoklama lusiferaz okumaları için en yaygın biçimi büyük ölçüde sırayla tek bir örnekten enzimatik faaliyetleri ölçmek için yeteneği ile kolay kullanımlı kitleri durumu verilen FL ve RL kullanımını gerektirir. En kitleri, numuneler ilk olarak eş zamanlı bir Secon vermek üzere koelenterazin tevdi bir söndürme reaktif takip FL aktivite düzeyleri ortaya çıkarmak için luciferase maruzdary RL sinyal. Bu GL veya kullanımı gibi Cypridina lusiferaz (CL), luciferases kullanarak yüksek miktarda veri ortaya çıkmıştır oluşturmak için olanaklar daha fazla sayıda başka substrat olarak salgılanan edilebilir diğer luciferases ilavesi ile. Bu tekniği kullanarak bir genom RNAi ekran bir örneği burada 6 bulunabilir. Bu teknolojik gelişmeler sırayla var çapraz konuşma 7 sınırlamak amacıyla lusiferaz enzim her tür gidermek için özel mekanizmaların geliştirilmesi teşvik. Bizim ellerde, bu tür GL veya CL olarak salgılanan luciferases ile, "kenar efektleri" (yüksek titre kültür plakaları kenarı ile ilişkili hücresel aktivite açıklanamaz eğilimler) bir daha sık not. Bu hücre canlılığı adulterating olmadan sinyali örnekleme izin gibi diğer yandan, salgılanan lusiferazlarm Kinetik tahliller için yararlıdır.
Burada sunulan Çalışmamızda için, aynı anda üç kansere ilgili faaliyet izleyecekhücresel süreçleri: p53, Kras ve Wnt sinyal ileti yolları. ,; Çalışmamızda dahil gazetecilere Clontech gelen pp53-TA-Luc FL muhabiri (bundan böyle p53-FL muhabiri olarak anılacaktır) 8, bir Elk1-GAL4/UAS-CL muhabiri sistemi (Agilent bundan böyle Elk-1 muhabiri) olan ve T-hücresi faktörler (veya TCFS) 9-11 olarak bilinen Wnt yolu transkripsiyonel düzenleyiciler tarafından tanınan birden fazla sentetik arttırıcı unsurları içermektedir 8X TCF RL muhabiri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ilk kez bir yüksek verimli ekran eğlenceli olanlar için yararlıdır on-line kaynak sağlamak lusiferaz tabanlı muhabiri sistemlerinin birkaç edicisidirler (örneğin Promega gibi, Hedefleme Sistemleri, New England Biolabs ve Thermo Fisher) vardır. Buna ek olarak, gen bulunması ve nasıl RNAi tabanlı tarama sonuçları diğer-omics tabanlı veri setleri ile entegre edilebilir için yüksek verimli ekranların kullanımını optimize ile ilgili mükemmel değerlendirmeleri bir dizi yararlı 15,16 olmal…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz CPRIT (RP100119) ve Welch Vakfı (I-1665) fon desteği kabul.
Materials
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 |
Riferimenti
- Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
- Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
- Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
- Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
- Lum, L. D., Kulak, O. Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. , (2012).
- Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
- DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
- . Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. , (2012).
- Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4 (2009).
- Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
- Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66 (2006).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338 (2011).
