마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법
Summary
랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.
Abstract
조절되지 않는 혈당은 당뇨병의 특징이며, 신경 병증, 신장 병증, 망막 병증과 같은 합병증을 촉진합니다. 당뇨병, 면역 매개 형 1과 비만 연결된 제 2 형 모두, 당뇨병의 병태 생리 및 치료 메커니즘을 서술하기위한 연구의 증가 유행으로 매우 중요하다. 췌장의 랑게르한스 섬의 β-세포가 적절하게 혈중 포도당 농도에 반응하여 인슐린을 분비하는 책임이 있습니다. 포도당 및 다른 영양소는, β-세포가 특정 호르몬에 의해 자극 또한, 세포 내 환상 아데노신 모노 포스페이트의 생산을 증가 β-세포 수용체의 식사 행동에 대한 응답으로 창자에서 분비되는 인크 레틴을, (라고 캠프). 감소 β-세포 기능, 대용량 및 인크 레틴 응답은 2 형 당뇨병의 병태 생리에 기여하는 잘 이해하고, 또한 점점 위스콘신 연결되고있다일 1 형 당뇨병. 본 마우스 섬 격리 및 캠프 결정 프로토콜은 질병의 진행 및 치료 적 개입, 세포 내 cAMP의 생산의 조절을 통해 행동 수용체를 인크 레틴 수용체에 의해 매개 또는 관련되는 특히 증진 메커니즘을 묘사하는 데 도움이 도구가 될 수 있습니다. 전용의 cAMP 측정이 설명 될 것이지만, 기술 된 아일렛 분리 프로토콜은 포도당, 인슐린 분비, [3 H] – 티미 딘 혼입 단백질 풍부하고, mRNA 발현을 자극 포함한 다른 많은 다운 스트림 애플리케이션을 허용 깨끗한 제제를 생성한다.
Introduction
euglycemia의 엄격한 관리는 조절되지 않는 제 1 형과 제 2 형 당뇨병 1의 병리의 모든 특징입니다과 같은 신경 병증, 신장 병증, 망막 병증과 같은 합병증을 방지하기 위해 필수적입니다. 제 1 형 및 2 형 당뇨병을 모두 감소 β-세포 기능 및 질량은 혈당 농도를 2 교란. 인슐린을 생산하는 β-세포, 손상된 β-세포의 인슐린 분비 및 형식 주변 인슐린 신호 2 형 당뇨병의 엄청난 손실 면역 매개 성 제 1 형 당뇨병의 결과를 함께 고혈당, 이상 지질 혈증, 결국 결과 증가 간 포도당 생산을 촉진하는 반면 각각의 β-세포 3 β-세포 질량과 인슐린 분비 능력의 상실. 모두 제 1 형 및 2 형 당뇨병의 진행에 기본 β-세포의 메커니즘을 이해하는 것은 희망이 질병을 예방하고 치료하는 새로운 치료로 상승을 줄 것이다.
체외 TI의그러한 INS-1과 같은 MIN6 ssue 배양 모델은, β-세포 라인을 불멸화 특정 β-세포의 기능을 이해하는데 유용한 도구가 될 수있다. 그러나, 베이 내의 상이한 세포 유형 간의 상호 작용 자체는 β-세포의 기능을 조절할 수있다. 예를 들어, 글루카곤의 주변 분비 영향 (α-세포에서 방출)과 인슐린 분비를 증가 및 감소에 소마토스타틴은 (δ-세포에서 방출), 각각 내분비 응답 4 셀 전지 근접의 중요성을 보여줍니다. 또한, β-세포 사이의 간극 결합 인슐린 5의 출시를 주다. 진보는 더 나은 포도당 고립 된 섬의 생리적 반응을 복제 인슐린 라인을 생성하는되었습니다 있지만 또한, (예를 들어, INS-1 유래 13분의 832 및 3분의 832 세포주), 자신의 포도당 응답은 여전히 정상 쥐와 다르다 6,7 섬. 또한, 이들 클론 인슐린 종 세포주 응답글루카곤 유사 펩타이드 -1 (GLP-1)의 효능을 서로 극적 다를뿐만 아니라, 통상의 아일렛 6 개있다. 따라서, 불후의 세포 라인 에이전트에게 캠프의 생산에 영향을 미치는 시금에 가장 적합한 모델을 대표하지 않을 수 있습니다.
인슐린 유래 세포 라인과는 대조적으로, 전체 동물 모델에서 유일하게 β-세포의 기능을 연구하는 것은 합병증의 자신의 세트를 제공합니다. 내분비 조직 작업에서 가장 큰 과제 중 하나는 방출 호르몬의 정확한 농도를 측정한다. 구체적으로, 간은 인슐린 대사에 중요한 역할을하고, 췌장의 혈류가 간으로 직접 진행한다. 따라서, 혈장 인슐린 둘레 정확하게 췌장 자체 또는 인슐린 분비 (8)의 속도에 다른 처리의 영향에서 분비되는 인슐린의 양을 묘사 할 수 없습니다. 또한, 글루카곤의 신 대사는 섬의 α-세포에서 글루카곤 9 출력의 신뢰성을 제한 할 수 있습니다. 따라서, 생체 외 실험에 대한 기본 마우스 섬을 분리하는 것은 섬이 생체 내에서 만들어 측정을 보완하기 위해 특정 자극에 응답하는 방식에 대한 정확한 이해를 제공합니다.
마우스 섬의 분리를위한 의정서는 (성공을 증가하는 데 도움이 될 수 있습니다 약간의 수정) 그룹의 수 (10, 11)에 의해 사용되는 잘 확립 된 프로토콜입니다. 또한, cAMP의 생산의 결정은 β-세포의 인크 레틴 반응성 직접 판독을 허용한다. 캠프 측정, 단백질 함량 및 인슐린 분비와 함께 또한 β-세포 기능에 결함이 캠프 10 근위부 또는 원위부 놓여 있는지 여부를 확인하는 데 도움이 같은 캠프 샘플 준비에서 정량화 할 수있다. 이 프로토콜의 마지막 캠프의 내용과 인슐린 분비 응용 프로그램이 다른 가운데, 제약 및식이 성분의 영향을 이해하기위한 매우 강력한 도구가 될 수 있습니다의, 캠프 및 인슐린 분비에. 단독 포도당의 자극 이외에, 다른 화합물이 캠프 및 인슐린 분비 10,11 변화를 측정하는데 사용될 수있다.
인슐린은 우리가 절연 아일렛 같은 글루카곤 및 소마토스타틴 같은 다른 호르몬,뿐만 아니라 사이토 카인, 에이코 사 노이드, 및 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 것으로 분석 차 호르몬이지만 마지막으로, 또한 과도 자극 분석 또는 정량함으로써 역시 측정 할 수있다 문화 매체 (12)에서 자신의 수준. 마지막으로, 다른 많은 다운 스트림 애플리케이션 등 섬 이식, PCR이나 마이크로 어레이 분석 정량 실시간에 대한 RNA 분리, 단백질로, 추구 할 수 있도록 외부에서이 원고의 범위, 기술 콜라게나 분리 방법 섬 격리 섬 보존 할 수 있지만, 웨스턴 블로 팅, 섬 매립 및 면역 형광 이미징 및 섬 세포 repli의 척도로서 [3H] – 티미 딘 설립을위한 격리이전 조브 기사 13-16에서 설명 된 일부 양이온. 전반적으로, 프로토콜에 설명 된 섬 격리 절차에 따라 치료법을 개발 및 β-세포의 기능을 강화하기위한 신약 개발을 촉진하기위한 중요하고 유용한 정보를 연구자를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세계 인구의 19.5 %에 영향을 미칠 것으로 예상 당뇨병의 유병율로, 신규의 연구 기술의 요구 사항을 모두 이해하고 18 당뇨병을 치료하는 데 필수적이다. 본 섬 격리는 시험관 실험에 사용되는 잘 확립 된 프로토콜이며, 약간의 수정을 11,14,16으로 이전에 제시되어 있습니다. 인슐린 분비는 캠프와 같은 업스트림 구성 요소에 초점을 맞추고, 고립 된 섬에 대한 일반적인 다운 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 작업에 설명 된 프로토콜에 대한 전문 기술 지원을 르네 L. Pasker 및 Harpreet K. Brar에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한, 우리는 우리에게 시간을 허용 자신의 실험실 구성원의 지원과 함께, 위스콘신 – 매디슨 대학의 듀크 대학 앨런 D. Attie 크리스토퍼 B. Newgard의 멘토링을 인정하고 최적화하기 위해 필요한 지원하고자하는 설명 프로토콜. 특히, 우리는 생산적인 토론과 조언을 Attie 연구소의 한스 Hohmeier, Danhong 루, 헬레나 윈필드 Newgard 연구소의 마리아 Rabaglia 감사합니다. 이 작품은 NIH 부여 DK080845 및 청소년 당뇨병 594에 의해 지원되었다
(MEK에 대한) 연구 재단 보조금 17-2011-608
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
Riferimenti
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
- Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
- Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
- Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
- Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
- Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
- Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
- Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
- Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
- Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
- Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
- Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
- Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).
