Transcriptomic Analyse van de Mens Retina Chirurgische Specimens gebruiken Journal
Summary
We gebruikten het netvlies monsters uit retinectomy voor een transcriptoom analyse netvliesloslating. We ontwikkelden een procedure die RNA conservering tussen de chirurgische blokken en het laboratorium maakt. We een gestandaardiseerd protocol voor RNA zuivering door cesiumchloride ultracentrifugatie te verzekeren dat de gezuiverde RNA's zijn geschikt voor microarray analyse.
Abstract
Netvliesloslating (RD) beschrijft een scheiding van de neurosensorische netvlies van de retinale pigment epitheel (RPE). De RPE is essentieel voor normale functie van de lichtgevoelige neuronen, fotoreceptoren. Loslating van het netvlies van het RPE leidt tot een fysieke spleet die is gevuld met de extracellulaire vloeistof. RD initieert cellulaire en moleculaire bijwerkingen die zowel de neurosensorische netvlies en de RPE sinds de fysiologische uitwisseling van ionen en metabolieten is ernstig verstoord beïnvloeden. De gevolgen voor visie van de duur van de onthechting omdat een snelle reapposition van de twee weefsels leidt tot het herstel van het gezichtsvermogen 1. De behandeling van RD is uitsluitend chirurgische. Verwijdering van glasvocht (vitrectomie) wordt gevolgd door de verwijdering niet essentiële deel van het netvlies in het vrijstaande gebied netvliesloslating begunstigen. De verwijderde retinale exemplaren zijn res nullius (niets) en dus normaal weggegooid.Om RNA te herstellen van deze chirurgische specimens, wij de procedure Journal dat RNA behoud mogelijk maakt tijdens de overdracht van de chirurgische blok naar het laboratorium ontwikkeld. Ook een gestandaardiseerd protocol voor RNA zuivering door cesiumchloride ultracentrifugatie te verzekeren dat de gezuiverde RNA's zijn geschikt voor globale genexpressie analyse. De kwaliteit van RNA werd gevalideerd door zowel RT-PCR en microarray-analyse. Analyse van de gegevens blijkt een gelijktijdige betrokkenheid van ontsteking en fotoreceptor degeneratie tijdens RD.
Introduction
Het belangrijkste therapeutische doel in netvliesloslating (RD) is een manier om fotoreceptorcel retinale schade en ontsteking als gevolg van de scheiding van de fotoreceptoren van de retinale gepigmenteerde epitheelcellen beperkt zijn. Tijdens RD, zijn RPE cellen geactiveerd, migreren, differentiëren, en vermenigvuldigen op het oppervlak van de vrijstaande netvlies, het uitoefenen van contractiele krachten die leiden tot complicaties. Transcriptomics analyse van RD is een manier om doel genen te identificeren met gewijzigde expressie na RD en dus toekomstige therapeutische moleculen die uiteindelijke visuele resultaat in combinatie met chirurgie zou kunnen verbeteren. Het is bekend ribonucleïnezuur (RNA) niet stabiel zijn desoxyribonucleïnezuur (DNA), welke laatste veel gebruikt voor genetische studies, de stabiliteit had sequentiebepaling van het genoom van Neanderthaler paleontologische monsters van meer dan 30.000 jaar 2 toegelaten. Transcriptie van DNA van de genen van het genoom in messenger RNA is debelangrijke proces genexpressie en de mRNA labiel is om een signaal vormen. RNAs zeer snel afgebroken door RNAse enzymen die het signaal beëindigen. Wanneer weefsels worden geïsoleerd uit een organisme, de RNAs vaak afgebroken voordat de expressie onderzocht in een onderzoekslaboratorium. Gedegradeerde RNA is niet geschikt voor analyse genexpressie. Omdat het laboratorium personeel niet kan deelnemen aan de operatie, we een procedure die is gemakkelijk ontwikkeld en vereist alleen dat de chirurg naar de weefsels te herstellen in een geschikte RNAse-vrije oplossing. Het RNA van de weefsels is stabiel en kan worden geanalyseerd zonder enig teken van afbraak na 72 uur bij kamertemperatuur in deze oplossing. De RNA's van specimens worden gezuiverd door middel van een gestandaardiseerde methode waarbij een ultracentrifuge op een cesiumchloridegradiënt na te zijn overgebracht naar het laboratorium 3. Vervolgens wordt de kwaliteit van het RNA bepaald door agarose gelelektroforese en RT-PCR. Het RNA zuivering protocol heeft devoordeel van het scheiden van de moleculen op dichtheid die verschillend is voor DNA en RNA en verzekert dat de RNA niet door een DNA-moleculen die kunstmatig signalen in genexpressie studies zullen genereren verontreinigd. Bovendien worden de overdracht RNA (tRNA), die kwantitatief zijn de meest voorkomende RNA in een cel, gescheiden naar dezelfde fysieke eigenschap van het ribosomaal RNA (rRNA) en boodschapper RNAs (mRNAs) die laatste twee namelijk de eindproduct van het zuiveringsproces. De verwijdering van tRNA van het preparaat bruikbaar omdat de meeste microarray analyse protocollen bij het gebruik van omgekeerde transcriptasen en RNA polymerasen die worden geremd door tRNA 4-6. Het gezuiverde RNA van chirurgische specimens worden gemerkt met een standaardprotocol en gehybridiseerd met een microarray chip en de resultaten worden geanalyseerd met twee complementaire methoden, de valse ontdekking thode en met een nieuwe methode van wederzijdse informatie en visualisatiezed op het web-based server Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ontwikkeling van een procedure voor weefsel herstel van de chirurgische blok essentieel voor het transcriptoom van netvliesloslating geweest. Men moet opmerken dat dit type van chirurgie wordt beoefend in nood en dat de oogartsen operationele hebben weinig tijd om deel te nemen in een biologisch onderzoeksprogramma wanneer zij opereren. Dit retinectomy wordt ook stochastisch uitgevoerd in elke dienst, zodat het eenvoudiger manier om statistische cijfers te bereiken is om te werken met een netwerk. In dergelijk netwer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Sacha Reichman en Dominique Santiard-Baron voor hun hulp bij het bewerken van de RNA-zuivering protocol.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Riferimenti
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochimica. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
