ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal
Summary
אנחנו השתמשנו בדגימות מרשתית retinectomy לניתוח transcriptomic של היפרדות רשתית. אנחנו פיתחה הליך המאפשר שימור RNA בין גושי הניתוח והמעבדה. אנחנו טופל בפרוטוקול כדי לטהר הרנ"א על ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח microarray.
Abstract
היפרדות רשתית (RD) מתארת הפרדה של רשתית נוירו מאפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית). הרשתית היא חיונית לתפקוד תקין של התאים העצב הרגישים לאור, photoreceptors. ניתוק של הרשתית מהרשתית יוצר פער פיזי, כי הוא מלא בנוזל חוץ תאי. RD יוזם תופעות לוואי תאיות ומולקולרית המשפיעות גם נוירו הרשתית והרשתית מאז חילופי פיסיולוגי של יונים ומטבוליטים הוא מוטרדים קשה. התוצאה עבור חזון קשורה לתקופת הניתוק מאז reapposition מהיר של תוצאות שתי הרקמות בשיקום הראייה 1. הטיפול בRD הוא אך ורק ניתוחי. הסרת ג'ל זגוגית (Vitrectomy) ואחריו הסרת חלק החיוני שאינו של הרשתית באזור המרוחק לטובת היפרדות רשתית. דגימות רשתית הסיר הם מיל nullius (שום דבר) וכתוצאה מכך בדרך כלל מושלך.כדי לשחזר RNA מן הדגימות כירורגית אלה, פיתחנו את כתב עת ההליך המאפשר לרנ"א שימור במהלך ההעברה מהבלוק כירורגית למעבדה. אנחנו גם טופל פרוטוקול לטהר הרנ"א על ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח ביטוי גנים הגלובלי. האיכות של RNA קבלה תוקף גם על ידי RT-PCR וניתוח microarray. ניתוח של הנתונים מראה מעורבות בו זמנית של דלקת וניוון photoreceptor במהלך RD.
Introduction
המטרה הטיפולית העיקרית בהיפרדות רשתית (RD) היא למצוא דרך להגביל את נזק photoreceptor תא ודלקת רשתית כתוצאה מההפרדה של קולטניים אור מתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית. במהלך RD, תאי הרשתית מופעלים, להעביר, dedifferentiate, ומתרבים על פני השטח של הרשתית המנותקת, הפעלת כוחות התכווצות שהובילו לסיבוכים. ניתוח transcriptomics של RD הוא דרך לזהות גני המטרה עם ביטוי שונה בעקבות RD ומולקולות טיפוליות עתידיות ומכאן שיכולים לשפר את התוצאה סופית חזותית בשילוב עם ניתוח. העובדה ידועה הוא חומצה ריבונוקלאית (RNA) אינה יציבה כפי שהיא חומצת deoxyribonucleic (DNA), האחרון בשימוש נרחב למחקרים גנטיים, יציבותו התירה הרצף של הגנום הניאנדרטלי מדגימות כפליאונטולוג של יותר מ -30,000 שנים 2. תמלול של ה-DNA של גנים מהגנום לתוך RNA השליח הואתהליך מרכזי בביטוי גנים, ואת ה-mRNA הוא יציב כדי להוות אות. RNAs מאוד במהירות מושפל על ידי RNAse אנזימים אשר לסיים את האות. כאשר רקמות מבודדות מהאורגניזם, את RNAs הם לעתים קרובות מאוד מושפל לפני הביטוי הוא למד במעבדת מחקר. RNA מושפל אינו מתאים לניתוח ביטוי גנים. כי צוות המעבדה לא יכול להשתתף בניתוח, פיתחנו הליך שהוא קל ורק דורש שהמנתח לשחזר את הרקמות לפתרון ללא RNAse מתאים. את הרנ"א של הרקמות הוא יציב וניתן לנתח ללא כל סימן של הידרדרות לאחר 72 שעות בטמפרטורת חדר בפתרון זה. את RNAs מדגימות הם מטוהרים על ידי שיטה סטנדרטית מעורבת ultracentrifugation בשיפוע צזיום כלוריד, לאחר שהועבר למעבדה 3. ואז, איכות של RNAs מוערכות על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ועל ידי RT-PCR. יש פרוטוקול טיהור RNAיתרון של הפרדת המולקולות על פי הצפיפות שלהם שהיא שונה עבור DNA ו-RNA ומבטיח כי רנ"א אינו מזוהם על ידי מולקולות הדנ"א שתפקנה אותות artifactual במחקרי ביטוי גנים. בנוסף, העברת RNAs (tRNAs), שהן כמותית את הרנ"א הנפוץ ביותר בתוך תא, מופרדים על פי אותו הנכס הפיזי מרנ"א ריבוזומלי (rRNAs) ואת RNAs השליח (mRNAs), שני אלה שעבר אחד להיות בסופו של תוצר הלוואי של תהליך הטיהור. הסרת tRNA מההכנה היא שימושית שכן רוב פרוטוקולי אנליטיות microarray כללו שימוש בtranscriptases בחסר וpolymerases RNA אשר מעוכבים על ידי tRNA 4-6. את הרנ"א מנוקה מדגימות כירורגית מסומנים באמצעות פרוטוקול סטנדרטי והכלאה לשבב microarray והתוצאות מנותחות באמצעות שתי שיטות משלימות, שיטת שיעור הגילוי הכוזבת, ושימוש בשיטה חדשה המבוססת על מידע הדדי וvisualized בשרת מבוסס אינטרנט Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפיתוח של הליך להתאוששות רקמה מהגוש כירורגית כבר חיוני לניתוח transcriptome של היפרדות רשתית. אחד צריך לשים לב כי סוג זה של ניתוח הוא התאמן בחירום ושיש לי ההפעלה רופאי העיניים קצת זמן כדי להשתתף בתכנית מחקר ביולוגית כאשר הם פועלים. retinectomy זה מבוצע גם stochastically בכל שירות, כך שה?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סשה רייכמן ודומיניק Santiard-רון על עזרתם בעריכת פרוטוקול טיהור רנ"א.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Riferimenti
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochimica. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
