Radical baseado em química biomimética tem sido aplicado para a construção de bibliotecas, necessários para o desenvolvimento de biomarcadores.
O envolvimento dos radicais livres em ciências da vida tem aumentado constantemente ao longo do tempo e tem sido ligado a vários processos fisiológicos e patológicos. Este assunto abrange diversas áreas científicas, abrangendo desde a química, física, biológica e bioorganic para a biologia e medicina, com aplicações para a melhoria da qualidade de vida, saúde e envelhecimento. Competências multidisciplinares são necessários para a investigação completa das várias facetas do processo radicais no ambiente biológico e químico conhecimento desempenha um papel crucial em revelar processos básicos e mecanismos. Nós desenvolvemos uma abordagem de biologia química capaz de se conectar a reatividade química de radicais livres com processos biológicos, fornecendo informações sobre as rotas mecanísticas e produtos. O núcleo da presente abordagem é a concepção de modelos biomiméticos para estudar o comportamento de biomoléculas (lípidos, ácidos nucleicos e proteínas) em sistemas aquosos, obtendo insights da reacção das vias, bem como ums construção de bibliotecas moleculares dos produtos livres de reação radical. Neste contexto, pode ser utilizada com sucesso para a descoberta de biomarcadores e exemplos são fornecidos com duas classes de compostos: mono-trans isómeros de ésteres de colesterol, que são sintetizados e utilizados como referência para a detecção em plasma humano, e de purinas 5 ',8-ciclo-2 '-desoxiribonucleósidos, preparados e utilizados como referência no protocolo para a detecção de lesões em amostras de DNA, depois de radiações ionizantes ou obtidos a partir de diferentes condições de saúde.
A reatividade de radicais livres revelou sua enorme importância para muitos eventos biológicos, incluindo o envelhecimento e inflamação. Hoje em dia, é cada vez mais evidente que a clarificação de cada passo químico envolvido nesta reactividade é necessário, de forma a compreender os mecanismos subjacentes e estratégias prevêem eficazes para o controlo de radicais livres e de reparação dos danos. A contribuição dos estudos químicos é fundamental, mas o estudo direto no ambiente biológico pode ser difícil, uma vez que a sobreposição de diferentes processos complica e perturba a análise dos resultados e as conclusões relacionadas. Assim, a estratégia de modelação reacções de radicais livres em condições biologicamente relacionados tornou-se um passo fundamental na investigação de mecanismos químicos em biologia.
Na última década, o nosso grupo desenvolveu modelos de processos do radical livre sob condições biomiméticos. Em particular, PTvisaged transformações biologicamente relevantes de ácidos graxos insaturados, nucleosídeos e enxofre contendo aminoácidos e colocá-los no caminho certo para ser avaliado e validado como biomarcadores do estado de saúde 1-4.
Nossa abordagem geral consiste de três módulos:
Nós escolhemos duas classes de biomarcadores para acreditar nesta abordagem: ésteres de colesterilo e de purinas 5 ',8-ciclo-2'-desoxiribonucleósidos.
A conversão de ocorrência natural de ácidos gordos insaturados cis para trans isómeros geométricos é uma transformação relacionada com a produção de stress radical no ambiente biológico. Lipidos da membrana celular, que contêm os ácidos gordos, é um alvo relevante para o stress biológico e radical que primeiro estudou a endógeno isomerização cis-trans fosfolípidos em culturas de células, animais e seres humanos que avaliam protocolos analíticos em cada caso. 8-10 Foi demonstrado que esta transformação pode ocorrer através de uma variedade de compostos contendo S, incluindo tióis, tioéteres e dissulfetos, que, sob diferentes condições de stress radicais são capazes de gerar radicais thiyl, ou seja, o agente de isomerização (Figura 3). O exemplo mostrado no artigo centra-se na classe de ésteres de colesterilo, que representam uma fracção muito conhecido de lípidos no plasma, estritamente envolvido no metabolismo das lipoproteínas. A ligação éster entre os ácidos gordos e chorol é biossintetizado pela transferência de ácidos gordos a partir da posição 2 da porção de glicerol de fosfatidil de colesterol, um passo catalisado pela enzima acil lecitina colesterol transferase (LCAT). Por isso, os ésteres de colesterol no plasma são estritamente relacionado com o volume de negócios lipídica da membrana, e contêm proporções relativamente elevadas dos ácidos gordos poli-insaturados (PUFA), tipicamente presentes em fosfatidilcolinas, isto é, linoleico e os ácidos araquidónico. Formação de lipoproteínas está envolvido em doenças cardiovasculares e metabólicas. A reactividade de ésteres de colesterilo naturais com os radicais livres podem ocorrer nas ligações duplas de linoleato e resíduos de ácido araquidônico, que podem ser transformados nos correspondentes isómeros geométricos trans (ver Figura 1 para as estruturas). Caracterização do teor de éster de colesterilo trans em amostras biológicas é interessante para o desenvolvimento de biomarcadores. Uma metodologia indirecta consiste na transformação de cholesteryésteres de l, isolada de plasma para os correspondentes ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME) e separação por protocolos cromatográficos de gás. Neste caso, a calibração das referências normalizadas de cis e trans de ésteres metílicos de ácidos gordos é executada, a fim de permitir a quantificação do teor de trans nas amostras. Com base nos estudos analíticos realizados sobre a biblioteca de éster de colesterilo, propôs-se aplicar também um método baseado na espectroscopia de Raman, que pode ser realizada directamente sobre a fracção de ésteres de colesterilo, isolada de plasma, sem derivatização após a FAME correspondente (ver Figuras 2 e 9). É interessante notar que até agora não existem métodos de sucesso são descritos para cis separado e isômeros trans de ácidos graxos contendo lipídios por HPLC, em vez como descrito por hidroperóxidos de éster de colesterol. Até agora, o método de cromatografia de gás indireta ainda é o melhor método disponível até agora. Por este método o primeiro quantitativa avação do conteúdo mono-trans a partir de ésteres de colesterol derivado isolado a partir de plasma de indivíduos saudáveis foram fornecidas. Usando Detector de Ionização de Chama (FID) do limite de detectabilidade é satisfatório (ppb) e as quantidades nanomolares dos compostos foram detectados. 5. Com sistemas de detecção de diferentes este limite pode ser ainda reduzido. O efeito da radiação ionizante em ésteres de colesterol é matéria de estudos adicionais, se uma resposta linear é obtido em relação à dose aplicada.
Como um segundo exemplo, escolhemos nucleósidos modificados que podem ser produzidos por radicais livres danos de DNA. Os radicais hidroxilo (HO •) são conhecidos por serem os mais prejudiciais Espécies reactivas de oxigénio (ROS) para a sua capacidade para causar modificações químicas de DNA. Lesões simples ou múltiplas podem ocorrer no DNA, que, em células eucarióticas está localizado no núcleo e as mitocôndrias. Identificação e medição das principais classes de oxidativos danos gerados ao DNA requerem o adequado doiate bibliotecas moleculares, a fim de definir os protocolos analíticos. Focamos nosso interesse sobre as lesões mais pequenas em tandem, os quais são purinas 5 ',8-ciclo-2'-desoxiribonucleósidos, tendo uma ligação covalente adicional entre a base e as porções de açúcar criadas pelo ataque de radicais livres. Os compostos são 5 ',8-ciclo-2'-desoxiadenosina e 5 ', 8-ciclo-2'-desoxiguanosina existente nos 5'R e 5'S formas diastereoméricas (Figura 5). O seu potencial para se tornar marcador de stress de radicais livres é a matéria de investigação fundamental. 2 Com efeito, quando o DNA é exposto a HO • abstração radical hidrogénio a partir da posição C5 'do açúcar é um dos possíveis eventos que conduzem à formação destas lesões em tandem. Purina 5 ',8-cyclonucleosides pode ser medido como a soma de diastereómeros por HPLC-MS/MS enzimaticamente digeridas em amostras irradiadas γ ADN variando 1-12 lesões / 10 6 nucleósidos / Gy indo ausência forma de oxigénio ao nível fisiológico de oxigénio Eutecidos n, a proporção diastereomérica 5'R / 5'S sendo ~ ~ 4 e 3 para 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdGuo, respectivamente (Figura 11). 11 É interessante notar que a relação entre a dose de radiação e 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdAdo lesões detectadas no ADN celular está longe de serem compreendidos. O experimento único baseado irradiação 2kGy relatado na experimental não podem ser considerados conclusivos. 11 Outras experiências deste tipo e quantificação do método dos quatro lesões são necessários para definir tais relações. A detecção destas lesões e as transformações oxidativas mais populares (tais como 8-oxo-2 '-desoxiguanosina, 8-oxodGuo) são assunto de investigações intensas, evidenciando a importância de ambas as lesões durante o metabolismo oxidativo. 6,13 O uso de HPLC -MS/MS (quadrupolo triplo) tem um limite de detecção de cerca de 30fmol para todos os quatro lesões. Melhorias últimos são requeridas para alcançar limites de detecção dos níveis attomol pela produ instrumentoRCEs. Com base na literatura recente, 6 procedimentos analíticos têm de incluir a limpeza adequada da amostra e o enriquecimento, a fim de satisfazer os limites de detecção da MS / MS / MS (armadilha de iões) ou da MS / MS (quadrupolo triplo) usado no nosso caso.
Bio-inspirados procedimentos de síntese de compostos 1-4 foram desenvolvidas a partir da 8-bromopurina derivados segundo ou fotólise. 7,12 Estes procedimentos envolvem a reacção em cascata radical que imita o mecanismo de dano do ADN de formação de 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdGuo lesões. A partir de perspectivas biológicas, verificou-se que estas lesões se acumulam com o envelhecimento de um modo específico do tecido (fígado> rim cérebro>), fornecendo a evidência de que os mecanismos de reparação de ADN são inadequadas para preservar o material genético a partir de tais lesões. 13 Com efeito, a reparação de excisão de nucleótidos (NER) é o único caminho actualmente identificados para a reparação das lesões. 2
A classe doises de compostos mostrados nas Figuras 1 e 5 não estão comercialmente disponíveis no momento, no entanto, por as estratégias de síntese descritos na literatura, não seria difícil de preparar estes compostos para uso comercial.
A abordagem multidisciplinar fornecida por estudos de biologia química não só tem um enorme valor para a identificação de novos mecanismos que ocorrem no ambiente biológico, mas também dá um contributo fundamental para a descoberta de biomarcadores e diagnóstico, em última análise, trazendo novidade em cuidados de saúde e estratégias de prevenção. 14 A contribuição química é necessária para um bom desenvolvimento da medicina molecular, criando plataformas integradas e painéis para perfis metabólicos, que se prevê venham a permitir uma óptima racionalização do desenho da intervenção, quer terapêutica e nutricional, reduzir as incertezas e falhas quando podem ser previsíveis.
The authors have nothing to disclose.
O apoio financeiro da dell'Istruzione Ministero, della Ricerca dell'Universita (PRIN-2009K3RH7N_002) e Marie Curie Fellowship intra-europeu (CYCLOGUO-298555), bem como o patrocínio da Acção COST CM0603 em "Radicais Livres em Biologia Química e Acção COST CM1201 em "Química Biomimetic Radical" Agradecemos imensamente.
MATERIALS | |||
Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
8-Bromo-2′-deoxyguanosine | Berry & Associates | PR3290-1 g | |
8-Bromo-2′-deoxyadenosine | Berry & Associates | PR3300-1 g | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
2′-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
2′-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
EQUIPMENT | |||
60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 |