Ontwerp van een tweeassige Mechanische belasting Bioreactor voor Tissue Engineering
Summary
We ontwierpen een nieuwe mechanische belasting bioreactor die eenassige of bi-axiale mechanische spanning voorafgaand aan de transplantatie kan toepassen op een kraakbeen biocomposite in een gewrichtskraakbeendefect.
Abstract
We ontwierpen een laadinrichting die van toepassing kan uniaxiaal of biaxiaal mechanische belasting een tissue engineered biocomposieten vervaardigd voor transplantatie. Terwijl het apparaat functioneert primair als een bioreactor die de natieve mechanische belasting nabootst, is ook uitgerust met een load cell te verschaffen force feedback of mechanische testen van de constructen. Het apparaat onderwerpen engineered kraakbeen constructies om biaxiale mechanische belasting met grote precisie van oplaaddosis (amplitude en frequentie) en is compact genoeg om te passen in een standaard weefselkweek incubator. Het laadt monsters direct in een weefselkweek plaat, en meerdere plaat maten zijn compatibel met het systeem. Het apparaat is ontworpen met behulp van onderdelen geproduceerd voor precisie-geleide laser-toepassingen. Bi-axiale belasting wordt bereikt door twee orthogonale fasen. De etappes hebben een 50 mm slaglengte en worden onafhankelijk aangedreven door stappenmotor actuatoren, bestuurd dooreen closed-loop stappenmotor driver die micro-stepping-mogelijkheden beschikt, waardoor stap kleiner dan 50 nm. Een polysulfon loading drukplaat gekoppeld met de bi-axiaal bewegend platform. Het verloop van de fasen worden gecontroleerd door Thor-labs Geavanceerde Positioning Technology (APT) software. De stappenmotor stuurprogramma wordt gebruikt met de software om bewakingsparameters frequentie en amplitude van zowel afschuiving en compressie onafhankelijk en gelijktijdig te passen. Positionele feedback wordt verstrekt door lineaire optische encoders die een bidirectionele herhaalbaarheid van 0,1 micrometer en een resolutie van 20 nm hebben, vertalen naar een positionele nauwkeurigheid kleiner dan 3 micrometer over de volledige 50 mm van reizen. Deze encoders zorgen voor de nodige terugmelding aan de aandrijfelektronica om ervoor te zorgen ware nanopositioning mogelijkheden. Om te voorzien in de force feedback op te sporen contact en evalueren laden reacties, wordt een precisie miniatuur load cell gepositioneerd tussen het laden plaat en de moving plateau. De load cell heeft een hoge nauwkeurigheid van 0,15% tot 0,25% volle schaal.
Introduction
We hebben een loading bioreactor die van toepassing kan uniaxiaal of biaxiaal mechanische belasting een tissue engineered biocomposieten vervaardigd voor transplantatie gemaakt. Dit apparaat is hoofdzakelijk ontworpen als een bioreactor van technisch vervanging van kraakbeen, maar kan ook worden gebruikt voor andere dragende weefsels in het menselijk lichaam. Onze motivatie in deze bioreactor ontwerp komt voort uit Drachman en Sokoloff 1, die de rudimentaire observatie van abnormale vorming van gewrichtskraakbeen in verlamde kippenembryo's door het ontbreken van beweging gemaakt. Ook lichaamsbeweging is essentieel voor normale ontwikkeling van spieren en botten. In overeenstemming met dit concept, hebben vele onderzoeksgroepen onderzocht hoe verschillende vormen van fysieke stimuli tijdens in vitro kweken moduleert de biochemische en mechanische eigenschappen van cel-biomateriaal biocomposieten en weefselexplantaten 2-7. Het begrip functionele tissue engineeringomvat het in vitro gebruik van mechanische stimuli om de functionele eigenschappen van weefsels verbeteren, dat wil zeggen de mechanische eigenschappen waarmee het weefsel bestand tegen de verwachting in vivo stress en spanning 8,9. Talrijke studies rapporteren het gebruik mechanische belasting in termen van afschuiving en compressie om engineered kraakbeen constructies te stimuleren voor articulaire gewrichten. Mauck et al.. 10 suggereren dat mechanische belasting alleen chondrogenese van mesenchymale stamcellen kan induceren, zelfs in afwezigheid van groeifactoren die essentieel worden beschouwd. Toepassing van intermitterende mechanische belastingen zoals druk of afschuiving tijdens weefselkweek is aangetoond moduleren kraakbeen en botvorming, maar de optimale dosimetrie van lading verschilt cellen en weefsels eigenschappen 11.
De belangrijkste functie van gewrichtskraakbeen is het vermogen om druk-en schuifkrachten weerstaan binnenhet gewricht, dus het moet een hoge druk-en afschuiving moduli hebben. Het ontbreken van functionele mechanische sterkte en fysiologische ultrastructuur in engineered kraakbeen heeft geresulteerd in de verdeling van neo-kraakbeen in vivo en het niet vervangingsstrategieën kraakbeen in gewrichten. Hoewel compressie en afschuiving zijn vaak aangetoond moduleren en verbeteren de mechanische sterkte van gewrichtskraakbeen biocomposieten, een combinatie aanpak is zeldzaam 6,12-15. Wartella en Wayne 16 ontwierp een bioreactor die spanning en compressie te meniscus kraakbeen vervangingen produceren toegepast. Waldman et al.. 15 bedoeld een inrichting voor compressie en afschuiving toepassing chondrocyten gekweekt in een poreuze calcium polyfosfaat substraat. Bian et al.. 17 aangetoond mechanische eigenschappen bijpassende inheemse kraakbeen met het in vitro kweken van volwassen honden chondrocyten in gels en toepassing van bi-axiale mechnische belasting (druksterkte deformational laden en sleepcontact laden).
De biaxiale mechanische belasting bioreactor werd oorspronkelijk ontworpen door Danielle Chu in ons laboratorium met de algemene doelstelling om morfologische aanpassingen induceren in tissue engineered kraakbeen construeert resulteert in een hogere druk-en afschuiving moduli dan momenteel beschikbaar 18. Wij geloven dat dit onderzoek zal aanzienlijk toenemen ons breder begrip van hoe mechanotransductie gemoduleerd om klinisch ingenieur relevante weefsels kunnen zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben ontworpen een laad-apparaat dat in staat is om het toepassen van eenassige of tweeassige mechanische belasting op weefselmanipulatieproducten constructies gefabriceerd voor transplantatie. De inrichting kan worden gebruikt als een bioreactor voor de in vitro kweek van gemanipuleerde biocomposieten of een testinrichting voor de mechanische eigenschappen van het natieve weefsel of als andere behandelingen voor beschrijven. De inrichting proefpersonen ontworpen weefselconstructen aan biaxiale mechanische…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Bureau van Onderzoek en Ontwikkeling, RR & D service, US Department of Veterans Affairs, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 en het ministerie van Defensie W81XWH-10-1-0643.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
Riferimenti
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Bilgen, B., et al. Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
