Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تطبيق على Published: May 31, 2013 doi: 10.3791/50390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

Summary

البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS) يلعب دورا حاسما في مكافحة الإجهاد الجرثومي. تتناول هذه المقالة تنقية

Abstract

الاكسدة هو نتيجة ثانوية لا مفر منه للحياة الهوائية. الأكسجين الجزيئي أمر ضروري لعملية التمثيل الغذائي للأرض، لكنه يأخذ أيضا في العديد من التفاعلات الضارة داخل الكائنات الحية. مزيج من الأيض الهوائي والحديد، وهو مركب حيوي آخر للحياة، ويكفي لإنتاج الجذور من خلال فنتون الكيمياء والحط من المكونات الخلوية. تدهور الحمض النووي يمكن القول إن عملية الأكثر إضرارا التي تنطوي على المتطرفين داخل الخلايا، كما إصلاح الحمض النووي لا يزال بعيدا عن تافهة. الفحص الواردة في هذه المادة تتيح تقنية الكمية لقياس وتصور تأثير الجزيئات والإنزيمات على الحمض النووي من التلف الراديكالي بوساطة.

فحص الحمض النووي الحماية هو أداة بسيطة وسريعة وقوية لتوصيف المختبر في من خصائص وقائية من البروتينات أو المواد الكيميائية. أنه ينطوي على تعريض DNA إلى رد فعل الأكسدة الضارة وإضافة تركيزات مختلفة من مجمع الفائدة. ثم هو تصور خفض أو زيادة الحمض النووي من التلف بوصفها وظيفة من تركيز مركب باستخدام الكهربائي للهلام. في هذه المقالة ونحن لشرح تقنية للمقايسة حماية الحمض النووي عن طريق قياس خصائص وقائية من البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS). DPS هو مصغرة الفيريتين التي يتم استخدامها من قبل أكثر من 300 الأنواع البكتيرية لمكافحة بقوة الضغوطات البيئية. هنا نقدم بروتوكول تنقية DPS وشروط الفحص الأمثل لتقييم حماية الحمض النووي من قبل DPS.

Introduction

يجب الكائنات الهوائية يتعامل باستمرار مع أنواع الاكسجين التفاعلية التي يمكن أن تضر الحمض النووي الخاصة بهم فضلا عن غيرها من الجزيئات البيولوجية حاسمة. واحدة أداة فعالة لمواجهة الآثار السامة من الضرر التأكسدي هو البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS). منذ اكتشافه في عام 1992 من E. المتعطشة القولونية الثقافة 1، وقد تم تحديد DPS في أكثر من 300 نوع من البكتيريا والعتائق 2. upregulation هائلة من DPS خلال مرحلة ثابتة يجعل من الاكثر أعرب عالية البروتين نوواني المصاحب من E. القولونية في ظل ظروف المجاعة 3، 4. بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين DPS للحفاظ على حد سواء الجدوى البكتيرية وسلامة الحمض النووي خلال العديد من الضغوط المختلفة، بما في ذلك الموت جوعا، وتركيز عالية من الحديد، التعرض للضوء الأشعة فوق البنفسجية، الصدمة الحرارية، والإجهاد التأكسدي 5، 6.

هيكليا، DPS-الزميلة النفس إلى مستقر معقد هومو بلازميدة قليلة القسيمات من 12 مونومرات، ثhich التجمع في قذيفة جوفاء كروية. التجويف الداخلي على نطاق نانومتر ~ 4.5 يمكن الوصول إلى الخارج المذيبات عبر المسام التي تسمح بمرور الجزيئات الصغيرة 7، وأنه يمكن عزل المعادن المعدنية مثل الحديد 8. تأثير وقائي من DPS مستمد من عدة أنشطتها والكيمياء الحيوية، والتي تشمل الحمض النووي غير محددة ملزمة 1، النشاط ferroxidase، وتخزين الحديد 8.

دراسة مفصلة عن الأنشطة البيوكيميائية المفيدة للDPS يتطلب أولا تنقية لها. DPS تنقية هو إجراء تفصيلا، كما يجب فصل DPS ليس فقط من البروتينات الأخرى، ولكن أيضا من أي الحمض النووي ملزمة 7. يستخدم لدينا عملية تنقية الأمثل العديد من التقنيات الشائعة، التي تتألف من عمودين التبادل الأيوني وكبريتات الأمونيوم خطوة هطول الأمطار. وهناك حاجة إلى العديد من التبادلات العازلة، كما DPS تتركز بشكل كبير يمكن أن تترسب من المحلول في ظروف قليل الملح. مرة واحدة وقد تم تنقية البروتين DPS، قد يتم تطبيقه على المقايسات التي تقيس مباشرة نشاطها ferroxidase 8، رياضيات الكيمياء الحمض النووي ملزم 9، وآليات ملزمة الحديد 10. لديه DPS تنقيته أيضا التطبيقات المحتملة الأخرى. تم استخدام هيكل كروي مجوف مستقرة من DPS كما السقالات لتخزين جزيئات مسعور داخل تجويف بروتين 11 وحتى غرفة رد فعل لتجميع الجسيمات النانوية المغناطيسية رواية 12.

القدرة واقية من DPS للتوسط الأضرار الناجمة عن أنواع الاكسجين التفاعلية يمكن أن تكون بشكل واضح وأظهر مباشرة باستخدام مقايسة حماية الحمض النووي 13 و 14. في هذا الإجراء في المختبر، ويتم إنتاج الأنواع جذري عندما يحفز الحديد H 2 O 2 من التدهور عن طريق فنتون الكيمياء. هذه الجذور تلف الحمض النووي الحالي مباشرة في رد الفعل ويمكن أن تتحلل تماما في تركيزات عالية. نشاطين DPS مفتاح قد كلا مواجهة مباشرة آثار Fentإنتاج الجذور على بوساطة. DPS يقلل من تركيز الحديد حافز عن طريق تمعدن، وتستهلك وبيروكسيد الهيدروجين المتوفرة في هذه العملية. بالإضافة إلى ذلك، قد DPS ملزمة لالحمض النووي يحتمل أن تكون حمايته جسديا من ضرر الجذور ويتكثف قبل أن تتحول إلى حجم أصغر مع مساحة أقل على رد الفعل. الجمع بين هاتين الخاصيتين يجعل فحص DNA حماية مناسبة تماما لغرض قياس النشاط DPS واقية.

مقايسة حماية الحمض النووي هي متعددة جدا، ويمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات خارج DPS التوصيف. الضرر الراديكالية هو شكل شائع من التوتر في الخلايا، وتستخدم العديد من البروتينات والمواد الكيميائية المختلفة لمواجهة ذلك. المبدأ العام للمقايسة، وذلك باستخدام الحمض النووي سلامة كعلامة للضرر الجذور، ويمكن استخدامها في تركيبة مع أي تقريبا رد فعل المنتجة للراديكالية أو مواجهة وكيل. من بين أمور أخرى، وقد استخدمت بنجاح الفحص لتحديد خصائص مضادة للأكسدةمن K. استخراج بانيكولاتا للاستخدام في الصناعات الغذائية 15، لوصف آثار حمض اليوريك على الهيدروكسيل الضرر الوساطة 16، واكتساب رؤى جديدة في وظيفة الفراء النسخي البروتينات منظم 17.

وعلى الرغم من الاستخدامات العديدة للمقايسة في الأبحاث المنشورة، وجدنا أن هناك حاجة إلى الكثير من التحسين والخطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، الأمر الذي يجعل إعداد مقايسة لأول مرة عملية شاقة بلا داع لكثير من الباحثين. بروتوكول نقدم في هذه المقالة تهدف إلى إزالة هذا الحاجز للدخول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DPS التعبير وتنقية

الحصول على بروتين عالية النقاء هو خطوة أولى أساسية لفحص الحمض النووي الحماية. تنقية DPS البروتين يمكن أن يؤديها في 4-5 أيام.

  1. تحويل سلالة البروتيني التي تعاني من نقص من E. القولونية (مثل BL21 (DE3) pLysS) مع ناقلات الحيوانات الأليفة (مثل pET17) إلى التي تم استنساخ DPS تسلسل البروتين الترميز.
  2. الإنتصارات وتحولت الخلايا خارجا على مرق لوريا (LB) لوحات أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (مثل الأمبيسلين والكلورامفينيكول لالأمثلة المقدمة في 1.1). احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. تطعيم مستعمرة واحدة من لوحة إلى 30 مل من المتوسط ​​LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 200-250 دورة في الدقيقة.
  4. تطعيم 2 × 1 L المتوسطة LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع 10 مل من كل ثقافة بين عشية وضحاها. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية، في حين تهتز، إلى OD 600
  5. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6،000 x ج لمدة 15 دقيقة. Resuspend وكريات خلية في 7.5 مل من العازلة DEAE A (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA) لكل لتر من زراعة الخلايا المستحثة. قد يتم تجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، إذا رغبت في ذلك. ويمكن عندئذ أن استمر الإجراء من قبل ذوبان العينات في حمام الماء عند 4 درجات مئوية.
  6. إضافة خليط من مثبطات الأنزيم البروتيني (مثل Calbiochem مجموعة III مثبطات الأنزيم البروتيني، في 0.167 ميكرولتر لكل مل من تعليق خلية) إلى تعليق خلية لمنع تدهور DPS بإفراط (overexpressed).
  7. إعداد مستخلص خالية من الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية. رئيس الصحافة الفرنسية مع 20 مل DEAE العازلة A (إذا باستخدام نموذج التدفق المستمر)، ثم disrupر العينة مرتين في 20 kpsi. أجهزة الطرد المركزي في المحللة في 30،000 x ج لمدة 35 دقيقة في 4 درجات مئوية لتوضيح جزيئات غير قابلة للذوبان، وحفظ طاف. قد ثم يتم تجميد طاف باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، إذا رغبت في ذلك.
  8. تتوازن 30 مل DEAE سيفاروز العمود CL-6B مع DEAE العازلة A، باستخدام FPLC. تشغيل المخزن المؤقت من خلال العمود في 1-2 مل / دقيقة مع أقصى قدر من الضغط من 0.2 ميجا باسكال على الخلفية. تحميل استخراج خالية من الخلايا على العمود، والبدء في جمع من خلال تدفق مرة واحدة تبدأ OD 280 إشارة إلى زيادة فوق خط الأساس. غسل العمود مع DEAE الاحتياطي A حتى يعود OD 280 القيمة إلى خط الأساس، في حين جمع مستمر التدفق من خلال. من خلال تدفق يجب أن يحتوي على غالبية البروتين DPS، وخالية من الحمض النووي ملزمة. غسل العمود مع 100٪ الواق B (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 1 M كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). هذا شطافة يحتوي المجمعات DPS-DNA وكذلك البروتينات الأخرى، ويمكن التخلص منها.
  9. إزالة الإعلاناتditional تلويث البروتينات من خلال الأمونيوم هطول كبريتات. تحديد حجم المجمعة خلال تدفق. ببطء (على مدى فترة من 10-20 دقيقة) إضافة الجافة سلفات الأمونيوم صغيرة من الحبوب إلى التشبع 62٪ (390 ملغ لكل مل من محلول) في 4 درجات مئوية مع التحريك جيدا. يقلب الخليط لمدة 20-30 دقيقة إضافية بعد إضافة الجزء الأخير من كبريتات الأمونيوم لضمان موازنة كاملة. ستبقى DPS القابلة للذوبان، بينما البروتينات تلويث سوف تترسب من المحلول.
  10. إزالة البروتينات المترسبة بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية وحفظ طاف.
  11. ببطء إضافة 227 ملغ كبريتات الأمونيوم إضافية لكل مل من طاف لتصل إلى 94٪ التشبع ويحرك المزيج لمدة 20-30 دقيقة لضمان موازنة كاملة. DPS يترسب في هذا تركيز الملح عالية، ويمكن جمعها بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. وسوف يكون في DPS بيليه، ويمكن أن يتم تجاهل طاف. يمكن تخزين بيليه في -80 ° C إذا قصرIRED.
  12. resuspend الكرية التي تحتوي على DPS في إعادة تعليق العازلة (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). ضبط حجم العينة إلى 2.5 مل.
  13. تبادل العازلة لإزالة كبريتات الأمونيوم باستخدام عمود الترشيح PD-10 هلام. تتوازن السرير هلام مع 25 مل العازلة إعادة تعليق. تطبيق مل 2.5 من عينة DPS إلى الجزء العلوي من العمود PD-10 والسماح لها نقع فيها تجاهل التدفق من خلال. جمع DPS بواسطة يبلغ حجمه مع 3.5 مل العازلة إعادة تعليق.
  14. أجهزة الطرد المركزي المخزن المؤقت تبادل عينة في 16،000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة أي مكونات غير قابلة للذوبان، وتمييع مع 6-10 مل العازلة تخفيف (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 0.1 ملي EDTA) لضمان أن تركيز الملح منخفضة بما فيه الكفاية لDPS لربط العمود سيفاروز SP. عينات مركزة خاصة من DPS قد تصبح أقل للذوبان على التخفيف في المخزن مؤقت أقل من الملح، كما يتضح من ملبد من السائل، ولكن يمكن resolubilized تماما قبل إضافة عمو الصغيرةNT من 5 M محلول كلوريد الصوديوم (وهي 10-20 ملم إضافية).
  15. تتوازن لمل SP سيفاروز عمود تدفق سريع 30 مع SP العازلة A (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). تشغيل المخزن المؤقت من خلال العمود في 1.5-2 مل / دقيقة مع الحد من الضغط 0.3 ميجا باسكال على الخلفية. تحميل العينة على العمود. يغسل مع SP الاحتياطي A حتى OD عائدات التتبع 280 إلى خط الأساس، وتجاهل التدفق من خلال. تشغيل الانحدار الخطي 150 مل 0-100٪ B الاحتياطي، في حين جمع الكسور 2 مل. سوف DPS أزل في ذروة حادة في حوالي 50٪ B، على الرغم من اختلاف بنسبة 10٪ هو ممكن.
  16. تشغيل الكسور شطف على 15٪ SDS-PAGE هلام، والتحقق من وجود تلوث الحمض النووي عن طريق قياس OD 260/280 OD نسبة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. الجل ينبغي أن تظهر فقط فرقة واحدة حوالي 19 كيلو دالتون، وOD 260/280 OD هو عادة حوالي 0.7. تجمع أنقى DPS الكسور. استخدام وحدة تصفية الطرد المركزي (مثل وحدة الترشيح Amicon الترا) مع10K الوزن الجزيئي وقف انتاج المواد الانشطارية لتركيز DPS ويتبادل عليها في المخزن مؤقت تخزين (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم). قسامة DPS تنقيته، والتجميد في النيتروجين السائل لتخزين في -80 درجة مئوية.

2. DNA الفحص حماية

ينطوي على فحص متعددة الخطوات حساسة للوقت، وينبغي تزامنت مع ثاني للحصول على نتائج قابلة للتكرار. وتشارك العديد من المكونات والخطوات pipetting ل، لذلك جدول pipetting ل(انظر الجدول 1) من المستحسن أن تتبع الخطوات وحدات التخزين. إجمالي الوقت اللازم لفحص وجود أكثر من 3 ساعة.

  1. قياس 30 مل من الماء إلى قارورة محكمة الإغلاق؛ تدفق المياه مع N 2 لمدة 10 دقيقة (باستخدام اثنين من الإبر المحاقن، واحدة في السائل، واحدة فوقه) لإزالة الأكسجين من الحل. أضف 0.0168 ز FESO 4 • 7H 2 O إلى الماء للحصول على محلول المخزون 2 مم. اغلاق القارورة وتدفق مع النيتروجين لمدة 5 دقائق أكثر، ثم خلط. يجب أن يكون الحلواضحة، وإذا كان أي تلميح من الأصفر قابلا للاكتشاف، وإعداد حل الحديد الجديدة.
  2. جعل ملم 100 H 2 O 2 حل (10.87 ميكرولتر من 9.2MH 2 O 2 في 1 مل من الماء)؛ الحفاظ على الجليد ومحمية من الضوء بواسطة التفاف في رقائق الألومنيوم. استخدم فقط لحوالي 1-2 ساعة بعد التحضير بسبب تسوس عفوية. الأسهم بيروكسيد الهيدروجين هو وبالمثل تخضع لانهيار، والتي يمكن تحسينها جزئيا التخزين السليم (في الظلام، في 4 درجات مئوية). ويوصى الشيكات العادية للتركيز الأسهم عن طريق قياس OD 240.
  3. ذوبان الجليد قسامة من المنقى DPS بسرعة في حمام مائي درجة حرارة الغرفة، والحفاظ على الجليد. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية في 4،000 x ج في جدول أعلى picocentrifuge إلى المجاميع راسب. قياس تركيز بعد الطرد المركزي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (OD 280 = 1.547 يشير إلى وجود تركيز من 100 DPS مونومر ميكرومتر).
  4. تمييع DNA خطي من الأوراق المالية عالية التركيز باستخدام 12X العازلة رد فعل (1M-MOPS KOH درجة الحموضة 7.0، 1 M كلوريد الصوديوم) إلى تركيز من 100 نانوغرام / ميكرولتر. ويستخدم الحمض النووي خطي لجعل الكمي أسهل، ولكن يمكن استخدام DNA البلازميد كذلك.
  5. ماصة 1 ميكرولتر من خليط الحمض النووي العازلة في أنبوب PCR. إضافة ما يكفي من الماء في رد فعل بحيث حجم رد الفعل النهائي (ناقص SDS) سيكون 12 ميكرولتر. ينبغي أن يحسب هذا المبلغ مقدما باستخدام الجدول pipetting ل. إضافة DPS إلى تركيز النهائي من dodecamer 3 ميكرومتر. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لDPS لربط الحمض النووي.
  6. إضافة ما يكفي من 2 ملي FESO 4 الحل للوصول إلى التركيز المطلوب. يستخدم تجربة نموذجية مجموعة من تركيزات 0-1 ملي FESO 4. سوف تركيزات أعلى يسبب تدهور الحمض النووي أكثر اتساعا ولكن قد يؤدي أيضا إلى تشكيل الحديد يترسب في خليط التفاعل. بسرعة إضافة 1 ميكرولتر من ملي H 2 O 2 حل 100 (إلى 10 ملي تركيز النهائي)، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح للفنتونبوساطة رد فعل تدهور لتأخذ مكان.
  7. إضافة 0.8 ميكرولتر من 20٪ SDS (كبريتات الصوديوم دوديسيل). خلط واحتضان عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل المجمعات DPS-DNA. وSDS يزعزع استقرار معقدة DPS-DNA، ويمنع التحولات هلام غير المرغوب فيها لDNA، مما يحسن من سهولة القياس الكمي. خطوة اختيارية هو وقف رد فعل من جانب المهينة حفاز بيروكسيد الهيدروجين إلى منتجات غير سامة. لظروف وصفها في هذا البروتوكول، ليست هناك حاجة لهذه الخطوة الحصول على مجموعة واسعة من تدهور الحمض النووي.
  8. احتضان على الجليد لمدة 1 دقيقة، إضافة صبغة التحميل، وتحميل على هلام الاغاروز. تشغيل هلام، وصمة عار لالحمض النووي باستخدام بروميد إيثيديوم. وينبغي أن يكون الجل الملون بعد الكهربائي بدلا من قبل الكهربائي، لمنع SDS من التدخل في توزيع بروميد إيثيديوم في هلام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عملية تنقية للDPS الموصوفة هنا هو تكرار للغاية. DPS تنقية وفقا للبروتوكول وصفها، وذلك باستخدام 2 لتر من E. ثقافة القولونية كنقطة انطلاق، وسوف تسفر عادة 2.5 مل من البروتين تحتوي على DPS 12 بتركيزات تتراوح بين 5 و 12 ميكرومتر. مرات الاستقراء أطول (4 ساعات) ويبدو للحد من هذه التقلبات. نقاء البروتين هو دائما فوق 99٪، كما يتضح من SDS-PAGE المواد الهلامية (الشكل 1). مستوى التلوث الحمض النووي لا يكاد يذكر على الدوام، كما يتضح من جانب كل من المواد الهلامية الاغاروز ملطخة عن الحمض النووي وOD 260/280 OD النسبة. هذه القيمة يمكن أن تختلف، ولكن القيم هي أبدا فوق 0.9، مشيرا إلى أن تظل مستويات التلوث الحمض النووي أقل بكثير من 5٪.

فإن استنساخ نتائج فحص الحمض النووي الحماية يعتمد إلى حد كبير على التنفيذ. إذا تم قياس تركيزات جميع المكونات على وجه التحديد (وخاصة تركيز البروتين بعد المركifugation)، والحضانة مرات للحصول على عينات متناسقة، فإن النتائج تشبه تلك التي تظهر باستمرار في الشكل 2. إذا كانت الظروف هي أقل مثالية، سوف تقلب طفيفة بين المقايسات تكون مرئية، على الرغم من زيادة عامة في تدهور الحمض النووي مع زيادة تركيز الحديد سوف يكون لا يزال واضحا. يمكن قياس النتائج التي تم الحصول عليها من خلال فحص الحمض النووي الحماية من خلال استخدام برامج معالجة الصور مثل ImageLab. ويبين الشكل 3 نتيجة هذا القياس الكمي، وبلغ متوسط ​​على مدى ثلاث المقايسات. أشرطة الخطأ تشير إلى ارتفاع المستوى استنساخ الحصول عليها.

الشكل 1
الشكل 1. الخطوات الوسيطة من DPS تنقية وتحليلها بواسطة SDS-PAGE (1) استخراج خالية من الخلايا؛ (2) التدفق من خلال عمود من DEAE سيفاروز، (3) شطافة العمود DEAE، (4) طاف من سول الأمونيوم 60٪ هطول مصير؛ (5) عينة DPS بعد 90٪ الأمونيوم هطول كبريتات وتبادل العازلة PD-10 عمود؛ (6) المجمعة DPS نقية الكسور بعد SP العمود سيفاروز؛ (7) علامات البروتين الوزن الجزيئي. النسب المئوية على الجزء السفلي من كل حارة دلالة DPS نقاء على النحو الذي يحدده البرنامج الكمي صورة (ImageQuant TL).

الشكل 2
الشكل 2. حماية DPS بوساطة من الحمض النووي من تدهور التأكسدي. جميع الممرات تحتوي على 100 ​​نانوغرام من الحمض النووي خطي 5 كيلو بايت. (1) الحمض النووي فقط، (2) الحمض النووي مع 1 ملم H 2 O 2، (3) الحمض النووي مع 1 ملم H 2 O 2 و 166 ميكرومتر FESO 4، (4) إلى (8) الحمض النووي مع DPS 3 ميكرومتر 12، 1 ملي H 2 O 2، وزيادة تركيز الحديد (0 ميكرومتر، 166 ميكرون، 333 ميكرون، 666 ميكرون و1،000 ميكرومتر) من اليسار إلى اليمين.

lways "> الشكل (3)
الشكل (3). جزء من DNA التالفة بوصفها وظيفة من تركيز الحديد، وبلغ متوسط ​​أكثر من ثلاثة التكرار للمقايسة حماية الحمض النووي. أشرطة الخطأ دلالة على الانحراف المعياري للمتوسط. الشروط: 100 نانوغرام من 5 KB خطي الحمض النووي، 1 ملم H 2 O 2، 3 DPS ميكرومتر 12 في 1 رد فعل العازلة X (83 ملم HEPES KOH-7.0 درجة الحموضة، 83 مم كلوريد الصوديوم). تم إجراء أي سيطرة البروتين باستخدام نفس الظروف، إلا مع DPS 12 تركيز 0 ميكرومتر.

الجدول 1
الجدول 1. مثال على جدول pipetting لالأساسية. نفذ pipetting للكل عمود في كل مرة، في ترتيب تسلسلي من اليسار إلى اليمين. يشار إلى فترة حضانة بعد كل خطوة pipetting لفي الصف الأخير. يشار إلى تجميع المكونات بواسطة علامة الجمع بين الخلايا في الأعمدة 3 و 4، مشيرا إلى أن الحمض النووي والبروتينات ينبغي pipetted من أنبوب واحد مشترك تحتوي على كل المكونات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عملية تنقية DPS كما هو موضح في هذه المقالة هي قوية للغاية. وكان نقاء باستمرار عالية (> 99٪)، وتظهر أي بروتينات أخرى على المواد الهلامية SDS-PAGE والعصابات مرئية. على الرغم من هذا، يبدو أن بعض دفعات من DPS تنقيته أن يكون النشاط نوكلياز، كما يتضح من تدهور الحمض النووي جزئية عندما حضنت مع تركيزات عالية جدا من المرحلين. قد يشير هذا إلى وجود DNases نشطة للغاية في تركيز منخفض لأننا لم نتمكن لإزالة من خلال تنقية. ومع ذلك، لوحظ هذا التدهور الحمض النووي فقط عند تركيزات التي لا يتم استخدامها عادة لفي فحوصات المختبر، لذلك لا يقدم عادة ما يكون مشكلة.

بروتوكول تنقية DPS كما وردت في هذه المقالة العديد من النقاط القوية. ليس لديها هذا البروتين أن يكون تقارب الموسومة، لذلك لا إمكانية التداخل مع وظيفة موجودا. البروتين النقي هو خالية من الحمض النووي، وذلك في فحوصات المختبر تنطوي سوف خصائص الحمض النووي ملزم لا تعانيمن التحف تلوث محتمل. وأخيرا، فإن DPS تنقيته تكاد لا تتضمن أية الحديد (<1 ذرات الحديد / DPS dodecamer) المخزنة داخل تجويف البروتين، من خلال الأسلوب الكمي ferene من الحديد 18، 19. هذه الميزة يجعل من الممكن التحكم بدقة ما يتم تحميل داخل تجويف DPS أو لاستخدام DPS أجوف معقدة مثل الصغرى المفاعل دون قلق إزاء التدخل.

فحص الحمض النووي الحماية هو وسيلة سريعة وموثوق بها لتوصيف خصائص علاجية من DPS في المختبر. تقدم هذه التقنية وسيلة مباشرة لإثبات فعليا تأثير وقائي من DPS التعبير على الجدوى الخلوية. الفحص يمكن استخدامها للحصول على بيانات كمية عن درجة الحماية التي توفرها الحمض النووي DPS أو الانزيمات الأخرى التي تكافح من الضرر التأكسدي، ويمكن اتخاذ العديد من الخطوات لتحسين استنساخ لها.

إعداد كاشف هو مرحلة هامة، كما concentratio دقيقةالقياسات غير ضرورية. فمن الأفضل لاستخدام نفس الرصيد الحمض النووي لجميع التجارب لضمان أن تركيز الحمض النووي لا تتقلب بين القياسات. في حالتنا نحن استخراج عدة ملليغرام من الحمض النووي البلازميد باستخدام طقم Maxiprep (PROMEGA) وهضمها إلى شظايا الخطية باستخدام انزيم التقييد القاطع واحد. بالإضافة إلى ذلك، لا اعادة تجميد البروتين DPS بعد ذوبان الجليد، والعمل دائما مع قسامة الطازجة وتكرار التجميد والذوبان قد يخفض النشاط. إعداد DPS aliquots في وقت تنقية في تقريبا نفس حجم كما يتطلب التجربة ومنع الهدر المفرط للبروتين. الطرد المركزي بسرعة البروتين قبل تركيز القياس أمر بالغ الأهمية، وإلا المجاميع البروتين يؤدي إلى overestimations من تركيز البروتين النشط. وأخيرا، وتكريس عدة عينات لرصد ما إذا كانت الكواشف تعمل كما هو متوقع (مثل الحمض النووي وحده، الحمض النووي مع H 2 O 2، الحمض النووي مع H 2 O 2 وFESO

فحص الحمض النووي حماية حساس جدا إلى العصور الحضانة، لذلك ينبغي أن توقيت كل خطوة بدقة قدر الإمكان. عند القيام العديد من التجارب، فإنه من المستحسن لارباك عينات للتأكد من أن فترات الحضانة تظل ثابتة بين العينات. حيث بلغ متوسطها خلال تجارب متعددة يساعد على إزالة أية أخطاء أدخلت خلال الأوقات الحضانة غير متناسقة، ولكن يمكن تقليل الخطأ الكلي من قبل توقيت دقيق.

يمكن اقتراح العديد من النصائح للباحثين الاستفادة المثلى من فحص الحمض النووي لحماية البروتينات (أو المواد الكيميائية) بخلاف DPS. الجانب الأكثر أهمية لتحسين هو نسب بين كمية الحمض النووي، ومعدل إنتاج الجذور، وحجم التأثير الوقائي الذي يتم التحقيق فيها. حتى تم العثور على النسبة المثلى، أظهرت العديد من المقايسات باستخدام DPS إما التدمير الكامل من الحمض النووي أو أي تأثير وقائي المرئي من الانزيم. في تجربتنا، وسيلة فعالة لPErform هذا التحسين هو لتحديد تركيز عال معقولة من البروتين، واختيار كمية الحمض النووي التي من شأنها أن تكون مرئية بشكل واضح على هلام دون oversaturating ذلك، وتحديد تركيزات محددة من H 2 O 2 و 4 في FESO فيها كل من الحمض النووي المتوفرة دمرت. بعد ذلك، سوف سلسلة من القياسات باستخدام مجموعة من FESO 4 تركيزات بين صفر والقيمة المحددة تكشف عن وجود مجموعة ديناميكية من حماية الحمض النووي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لميشيلا دي مارتينو، ويلفريد R. هاجن، وكوروش Honarmand ابراهيمي لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل بدء التمويل من جامعة دلفت للتكنولوجيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3)pLysS competent cells Promega L1195
pET-17b DNA EMD-Millipore 69663-3
LB broth powder Sigma-Aldrich L3022
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
IPTG Sigma-Aldrich I6758
HEPES BDH 441476L
Potassium hydroxide Merck 105033
Sodium chloride VWR 443824T
EDTA Sigma-Aldrich E9884
Protease Inhibitor Cocktail Set III EMD-Millipore 539134
DEAE-Sepharose Sigma-Aldrich DFF100
Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A4418
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare LS 17-0851-01
SP-Sepharose Sigma-Aldrich S1799
Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) Millipore UFC901024
Ferrous Sulphate heptahydrate Sigma-Aldrich F8048
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763
MOPS Calbiochem 475898
SDS solution Bio-Rad 161-0418
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510
Static incubator Hettich INE500
Shaking Incubator New Brunswick Sc. Inova 44
Cooled centrifuge Beckman Coulter Avanti J-E
Table-top centrifuge Eppendorf 5424
Cell disrupter Constant Systems Ltd. TS2/40/AA/AA
FPLC Purifier General Electric AKTA
Airtight vials Cole-Parmer EW-08918-85
Syringe needles BD 305128
Pipettes Eppendorf Z683779-1EA, Z683795-1EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
  2. Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
  3. Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
  4. Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
  5. Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
  6. Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
  7. Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
  8. Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
  9. Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
  10. Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
  11. Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
  12. Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).
  13. Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
  14. Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).
  15. Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
  16. Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
  17. Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
  18. Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
  19. Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).

Tags

علم الوراثة، العدد 75، علم الأحياء الدقيقة، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الخلوية والكيمياء الحيوية وعلم الجينوم، والبروتينات، والبكتيريا والأحماض النووية، النيوكليوتيدات، تطبيقات الكيميائية والاستخدامات، الإنزيمات، كالأنزيمات المشاركة، العلوم الحياتية (العامة)، DPS، حماية الحمض النووي، ferroxidase، الضرر التأكسدي، استجابة الإجهاد، والحمض النووي، والحمض النووي من التلف، وإصلاح الحمض النووي، الاكسدة، ثقافة الخلية
تطبيق على<em&gt; في المختبر</em&gt; الحمض النووي الفحص حماية لتصور الإجهاد خصائص الوساطة من البروتين DPS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karas, V. O., Westerlaken, I.,… More

Karas, V. O., Westerlaken, I., Meyer, A. S. Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein. J. Vis. Exp. (75), e50390, doi:10.3791/50390 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter