Applicering av en<em> In vitro</em> DNA Protection Assay att visualisera Egenskaper Stress medling Dps Protein
Summary
Den DNA-bindande protein från svultna celler (DPS) spelar en avgörande roll i kampen mot bakteriell stress. Denna artikel diskuterar rening av<em> E. coli</em> Dps samt protokollet för en<em> In vitro</em> Analysen visar Dps-medierad skydda DNA från nedbrytning av reaktiva syreradikaler.
Abstract
Oxidativ stress är en oundviklig biprodukt av aerob liv. Molekylärt syre är avgörande för marksänd metabolism, men det tar också del i många skadliga reaktioner i levande organismer. Kombinationen av aerob metabolism och järn, vilket är en annan viktig förening för livet, är tillräckligt för att producera radikaler genom Fenton kemi och försämra cellulära komponenter. DNA nedbrytning är utan tvekan den mest skadliga process där intracellulära radikaler, såsom DNA-reparation är långt ifrån trivialt. Analysen som presenteras i denna artikel erbjuder en kvantitativ teknik för att mäta och visualisera effekten av molekyler och enzymer på radikal-medierad DNA-skada.
Den DNA-skydd analysen är en enkel, snabb och robust verktyg för in vitro-karakterisering av de skyddande egenskaperna hos proteiner eller kemikalier. Det handlar om att exponera DNA till en skadlig oxidativ reaktion och tillsats av varierande koncentrationer av föreningen av intresse. Minskningen eller ökning av DNA-skada som en funktion av föreningens koncentration därefter visualiseras med gelelektrofores. I denna artikel kommer vi demonstrera tekniken för DNA-skydd analysen genom att mäta de skyddande egenskaperna hos det DNA-bindande protein från svultna celler (DPS). Dps är en mini-ferritin som används av mer än 300 bakteriearter att kraftfullt bekämpa miljöpåverkande faktorer. Här presenterar vi de Dps reningsprotokollet och de optimerade betingelser analys för att utvärdera DNA skydd av UP.
Introduction
Aeroba organismer måste ständigt brottas med reaktiva syreradikaler som kan skada deras DNA samt andra viktiga biologiska makromolekyler. Ett kraftfullt verktyg för att motverka de toxiska effekterna av oxidativ skada är den DNA-bindande protein från svultna celler (DPS). Sedan upptäckten 1992 från svultna E. coli kultur 1, har Dps identifierats i mer än 300 arter av bakterier och Archaebacteria 2. Massiva uppreglering av Dps under stationär fas gör det mest kraftigt uttryckt nucleoid-associerat protein av E. coli under svält förhållanden 3, 4. Dessutom har Dps visats bevara både bakterie livskraft och DNA integritet under många olika påfrestningar, bland annat svält, höga järn koncentration, UV-ljus exponering, värmechock, och oxidativ stress 5, 6.
Strukturellt Dps själv-associerar till en stabil homo-oligomera komplex av 12 monomerer, which montera in ett sfäriskt ihåligt skal. Den ~ 4,5 nm-omfattande inre hålighet är tillgänglig till det yttre lösningsmedlet via porer som tillåter passage av små molekyler 7, och det kan sekvestrera mineraliserade metaller såsom järn 8. Den skyddande effekten av Dps härrör från dess flera biokemiska aktiviteter, som inkluderar icke-specifik DNA-bindning 1, ferroxidase aktivitet, och järn lagring 8.
Detaljerad studie av de positiva biokemiska aktiviteter Dps kräver först dess rening. Dps rening är en utarbetad förfarandet, såsom Dps måste separeras inte bara från andra proteiner, men också från alla bundna DNA 7. Vår optimerade reningsprocess använder många vanliga tekniker, som består av två jonbyteskolonner och en ammoniumsulfatutfällning steg. Flera buffert utbyte behövs, så högkoncentrerade Dps kan fällas ut ur lösningen i låga salthalt. När Dps protein har renats, Kan den tillämpas på analyser som direkt mäter sin ferroxidase aktivitet 8, DNA-bindande stökiometri 9, och mekanismer för järnbindande 10. Renade Dps har även andra potentiella tillämpningar. Den stabila ihåliga sfäriska struktur av UP har använts som byggnadsställningar för lagring av hydrofoba partiklar inuti proteinet hålrummet 11 och även som en reaktionskammare för att syntetisera nya magnetiska nanopartiklar 12.
Den skyddande förmåga Dps att medla skador på grund av reaktiva syreradikaler kan vara tydligt och direkt påvisas med hjälp av analysen DNA skydd 13, 14. I detta in vitro-procedur, är radikala arter bildas när järn katalyserar H 2 O 2 nedbrytning genom Fenton kemi. Dessa radikaler skada direkt DNA närvarande i reaktionen och kan helt bryta ned den i höga koncentrationer. Två viktiga Dps aktiviteter kan både direkt motverka effekterna av Fenton-medierad radikalproduktion. Dps sänker koncentrationen av katalytiskt järn genom mineralisering, förbrukar den tillgängliga väteperoxiden i processen. Dessutom kan Dps bindning till DNA skydda potentiellt den fysiskt från radikaler och kondenserar den till en mindre volym med mindre reaktiv yta. Kombinationen av dessa två egenskaper gör analysen DNA skyddet väl lämpad för att mäta skyddande Dps aktivitet.
Den DNA-skydd analysen är ganska mångsidig och kan användas för en mängd olika applikationer utöver Dps karakterisering. Radikaler är en vanlig form av stress i celler, och många olika proteiner och kemikalier används för att motverka det. Den allmänna principen för analysen, använda DNA integritet som en markör för radikal skada, kan användas i kombination med nästan alla radikal-producerande reaktion eller motverka agent. Bl.a. har analysen använts framgångsrikt för att bestämma anti-oxidativa egenskaperav K. paniculata extrakt för användning inom livsmedelsindustrin 15, för att karakterisera effekterna av urinsyra på hydroxyl skador medling 16, och för att få nya insikter i funktionen av päls transkriptionsregulator proteiner 17.
Trots de många användningsområden för analysen i publicerade artiklar, fann vi att många optimering och steg felsökning krävdes, vilket gör installationen analysen för första gången en onödigt arbetsam process för många forskare. Protokollet vi presenterar i denna artikel syftar till att undanröja detta hinder för inträde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reningsförfarandet av UP som beskrivs i denna artikel är mycket robust. Renhet har genomgående varit hög (> 99%), inga andra proteiner visas på SDS-PAGE geler som synliga band. Trots detta kvarstår vissa partier av renade Dps verkar ha nukleasaktivitet, vilket framgår av partiell DNA-nedbrytning vid inkubation med mycket höga koncentrationer av UP. Detta skulle kunna tyda på förekomsten av högaktiva DNaser vid låg koncentration att vi inte kunde ta bort genom rening. Detta är dock DNA nedbrytning endast …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, och Kourosh Honarmand Ebrahimi för nyttiga diskussioner. Detta arbete stöddes av start-up finansiering från Delft University of Technology.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 |
| HEPES | BDH | 441476L |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 |
| Sodium chloride | VWR | 443824T |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 |
| MOPS | Calbiochem | 475898 |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 |
| Equipment | Company | Model |
| Static incubator | Hettich | INE500 |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 |
| Syringe needles | BD | 305128 |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
Riferimenti
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
- Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
- Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
- Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
- Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
- Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
- Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
- Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
- Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
- Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. Chimica. 16 (2), 709-717 (2010).
- Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
- Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. Biochimica. 44 (15), 5572-5578 (2005).
- Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
- Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
- Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
- Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
- Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).
