Hasret hücreler (DPS) gelen DNA-bağlayıcı protein bakteriyel stres mücadelede önemli bir rol oynar. Bu makalenin arıtma ele<em> E. coli</em> DPS ve için protokol<em> In vitro</em> Test reaktif oksijen türleri tarafından bozulması DNA DPS-aracılı koruma gösteren.
Oksidatif stres aerobik yaşamın kaçınılmaz bir yan ürünü. Moleküler oksijen karasal metabolizması için gereklidir, ama aynı zamanda canlılar içinde birçok zararlı reaksiyonlar yer almaktadır. Yaşam için başka önemli bir bileşiktir aerobik metabolizma ve demir, kombinasyonu Fenton kimya ile radikaller üretmek ve hücresel bileşenleri azaltmak için yeterlidir. DNA tamiri çok önemsiz olduğu gibi DNA bozulması, belki hücre içi radikaller içeren en çok zarar veren bir süreçtir. Bu makalede sunulan tahlil radikal aracılı DNA hasar molekülleri ve enzimlerin etkisini ölçmek ve görselleştirmek için nicel bir teknik sunmaktadır.
DNA koruma deneyi protein ya da kimyasal koruyucu özelliklerinin in vitro karakterizasyonu için, basit, hızlı ve güçlü bir araçtır. Bu zararlı oksidatif reaksiyona DNA açığa çıkar ve çeşitli bileşik konsantrasyonları eklemeyi içerir. Bileşik konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, DNA hasarının azaltılması veya artışa daha sonra jel elektroforezi kullanılarak görselleştirildi. Bu yazıda aç bırakılmış hücreler (DPS) DNA-bağlayıcı proteinin koruyucu özelliklerini ölçerek, DNA koruma deneyi tekniğini göstermektedir. Dps güçlü çevresel stres ile mücadele için 300'den fazla bakteri türleri tarafından kullanılan bir mini-ferritin olduğunu. Burada DPS arıtma protokolü ve DPS tarafından DNA koruma değerlendirmek için optimize edilmiş test koşulları sunuyoruz.
Aerobik organizmalar sürekli olarak DNA hem de diğer önemli biyolojik makromoleküllerin zarar verebilir reaktif oksijen türleri ile uğraşmak gerekir. Oksidatif hasar toksik etkilerini ortadan kaldırmak için bir güçlü bir araç hasret hücreler (DPS) DNA-bağlayıcı proteindir. Hasret E. 1992 yılında keşfedilmesinden bu yana coli kültürü 1, DPS bakteri ve Archaebacteria 2 300'den fazla türün tespit edilmiştir. Sabit faz sırasında DPS Massive upregülasyonu bu E. en çok ifade nükleoit-ilişkili protein yapar açlık koşulları 3, 4 altında coli. Buna ek olarak, DPS açlık, yüksek demir konsantrasyonu, UV ışığına maruz bırakma, ısı şoku ve oksidatif stres 5, 6 da dahil olmak üzere pek çok çeşitli stres sırasında bakteriyel canlılığı ve DNA bütünlüğünü korumak için de gösterilmiştir.
12 monomerlerin, w istikrarlı bir homo-oligomerik kompleksi içine Yapısal olarak, DPS kendini ortaklarıhich bir küresel içi boş kabuk içine monte. ~ 4.5 nm çapında iç boşluğu küçük moleküllerin 7 geçişine izin gözenekleri ile çözücü dış erişilebilir, ve demir 8 gibi mineralli metaller ayırmak olabilir. DPS koruyucu etkisi non-spesifik DNA bağlayıcı 1, ferroxidase aktivite, ve demir depolama 8 de onun çeşitli biyokimyasal faaliyetleri, türemiştir.
DPS yararlı biyokimyasal faaliyetlerin ayrıntılı çalışma ilk olarak arıtma gerektirir. DPS sadece başka proteinler ayrı olarak, aynı zamanda herhangi bir bağlı DNA'nın 7 olması gerektiği gibi DPS saflaştırma, karmaşık bir işlemdir. Optimize edilen saflaştırma işlemi, iki iyon değişim ve amonyum sülfat ile çöktürme kademesi oluşan, çok yaygın teknikleri kullanır. Son derece konsantre DPS düşük tuz koşullarında çözüm dışında hızlandırabilir gibi çeşitli tampon değişim, ihtiyaç vardır. Bir kez DPS saflaştırılmış protein edilmiştir, Bu doğrudan ferroxidase aktivitesi 8, DNA bağlayıcı stokiyometri 9 ve 10 demir bağlama mekanizmaları ölçmek deneyleri ile uygulanabilir. Saf DPS de diğer potansiyel uygulamalar vardır. DPS sabit içi boş küresel yapısı, proteinin boşluğu 11 içine hidrofobik parçacıkların depolamak için iskelesi olarak kullanılmış ve bir reaksiyon haznesi yeni bir manyetik nano partiküller 12 sentezlemek için bile.
Reaktif oksijen türleri nedeniyle zarar arabuluculuk DPS bir koruyucu yeteneği açıkça olması ve doğrudan DNA koruma deneyi 13, 14 ile ispat edilebilir. Demir Fenton kimya ile H 2 O 2 bozulması katalize zaman in vitro prosedüründe bu, radikal türleri üretilmektedir. Bu radikaller doğrudan reaksiyon DNA mevcut zarar ve tamamen yüksek konsantrasyonlarda bu düşürebilir. İki anahtar DPS faaliyetleri doğrudan Fent etkilerini karşı olabilir hemon-aracılı radikal üretimi. DPS sürecinde mevcut hidrojen peroksit tüketen, mineralizasyon ile katalitik demir konsantrasyonunu düşürür. Ayrıca, DNA bağlayıcı DPS potansiyel radikal hasarına karşı fiziksel olarak korumak ve daha az reaktif yüzey alanına sahip daha küçük bir hacim içine yoğunlaştırır olabilir. Bu iki özellik kombinasyonu de koruyucu DPS aktivitesinin ölçülmesi amacıyla, uygun DNA koruma deneyi yapar.
DNA koruma deneyi oldukça çok yönlü ve DPS karakterizasyonu ötesinde çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Radikal hasar hücrelerinde stres yaygın bir şeklidir, ve birçok farklı protein ve kimyasalların, önlemek için kullanılır. Radikal hasarı için bir belirteç olarak DNA bütünlüğü kullanılarak tahlil genel ilkesi, hemen hemen her türlü radikal üreten reaksiyon ya da mücadele maddesi ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Diğerleri arasında, tahlil, başarılı bir şekilde bir anti-oksidatif özelliklerini belirlemek için kullanılmıştırK. hidroksil zarar arabuluculuk 16 ürik asit etkilerini karakterize etmek ve Kürk transkripsiyonel regülatör proteinlerin 17 fonksiyonu yeni bakış açıları kazanmak için gıda sektöründe 15, kullanılmak üzere Paniculata özü.
Yayınlanan gazetelerde testin çeşitli kullanımlarını rağmen, ilk kez birçok araştırmacı için gereksiz yere zahmetli bir süreç için tahlil kurma yapar, birçok optimizasyon ve sorun giderme adımları gerekli olduğunu bulundu. Bu makalede mevcut protokol giriş için bu engeli kaldırmayı amaçlamaktadır.
Bu makalede açıklanan DPS bir arınma süreci çok sağlamdır. Saflık sürekli (>% 99) yüksek olmuştur; başka proteinler görünür bantları gibi SDS-PAGE jel görünür. DPS çok yüksek konsantrasyonları ile inkübe, kısmi DNA yıkımı ile kanıtlandığı gibi buna rağmen, saflaştırılmış DPS bazı gruplar, nükleaz aktivitesi var gibi görünmektedir. Bu, arıtma yoluyla kaldırmak koyamadık, düşük konsantrasyonda yüksek derecede aktif DNase'lann varlığına işaret olabilir. Bununla bir…
The authors have nothing to disclose.
Biz Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, ve yararlı tartışmalar için Kourosh Azim Honarmand İbrahimi minnettarız. Bu çalışma Delft Teknoloji Üniversitesi'nden finansman start-up tarafından desteklenmiştir.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number |
BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 |
pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 |
HEPES | BDH | 441476L |
Potassium hydroxide | Merck | 105033 |
Sodium chloride | VWR | 443824T |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 |
DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 |
Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 |
SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 |
Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 |
Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 |
MOPS | Calbiochem | 475898 |
SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 |
Equipment | Company | Model |
Static incubator | Hettich | INE500 |
Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 |
Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E |
Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 |
Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA |
FPLC Purifier | General Electric | AKTA |
Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 |
Syringe needles | BD | 305128 |
Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |