Permanente oclusión vascular cerebral<em> Vía</em> Ligadura doble y transección

Summary

Se describe un método altamente reproducible para la oclusión permanente de un vaso sanguíneo principal cerebral de roedor. Esta técnica se puede lograr con muy poco daño periférico, mínima pérdida de sangre, una alta tasa de supervivencia a largo plazo, y el volumen del infarto coherente acorde con la población clínica humana.

Abstract

El accidente cerebrovascular es la principal causa de muerte, discapacidad y pérdidas socioeconómicas en todo el mundo. La mayoría de todos los accidentes cerebrovasculares resultado de una interrupción en el flujo sanguíneo (isquemia) ^1. La arteria cerebral media (ACM) ofrece una gran mayoría de la sangre a la superficie lateral de la corteza ^2, es el sitio más común de accidente cerebrovascular humano ^3, y la isquemia dentro de su territorio puede resultar en la muerte o la disfunción extensa ^1,4,5. Los sobrevivientes de un accidente cerebrovascular isquémico menudo sufren pérdida o alteración de las capacidades motoras, déficit sensorial, e infarto. En un esfuerzo para capturar estas características clave de accidente cerebrovascular, y de este modo desarrollar un tratamiento eficaz, una gran cantidad de énfasis se pone sobre modelos animales de isquemia en MCA.

Aquí se presenta un método de oclusión permanente de un vaso sanguíneo superficie cortical. Vamos a presentar este método con un ejemplo de una oclusión de los vasos relevante que modela el tipo más común, la ubicación y outcome de la carrera humana, oclusión de la arteria cerebral media permanente (pMCAO). En este modelo, nos exponemos quirúrgicamente MCA en la rata adulta y, posteriormente, a través de ocluir doble ligadura y la sección transversal del recipiente. Este pMCAO bloquea la rama cortical proximal de la MCA, causando isquemia en todo el territorio de la MCA cortical, una gran porción de la corteza. Este método de oclusión también se puede utilizar para ocluir porciones más distales de los vasos corticales con el fin de lograr la isquemia focal más centradas en una región más pequeña de la corteza. Las desventajas principales de pMCAO son que el procedimiento quirúrgico es un poco invasivo ya que se requiere una pequeña craneotomía para acceder a MCA, aunque esto da como resultado un daño mínimo del tejido. Las principales ventajas de este modelo, sin embargo, son: el sitio de la oclusión está bien definido, el grado de reducción del flujo sanguíneo es coherente, funcional y deterioro neurológico se produce rápidamente, el tamaño del infarto es consistente, y la alta tasa de supervivencia permite a largo evaluación crónica plazo.

Introduction

Con el fin de inducir estados isquémicos que imitan efectivamente accidente cerebrovascular isquémico humano, varios modelos animales de accidente cerebrovascular se emplean ampliamente, con diferentes volúmenes de infarto resultantes. En el modelo de photothrombotic, el cerebro se irradia a través del cráneo intacto utilizando iluminación láser después de la inyección intravenosa de una sustancia fotosensible (por ejemplo, rosa de bengala-), lo que resulta en la coagulación fotoquímica, obstrucción de los vasos irradiados, y la isquemia en el tejido circundante ^{6, 7.} Photothrombosis puede resultar en regiones muy pequeñas, aisladas de infarto y se utiliza típicamente como un medio de modelado "mini derrames cerebrales", o "micro-accidentes cerebrovasculares".

La técnica más ampliamente adoptado para la inducción de accidente cerebrovascular isquémico, particularmente en la arteria cerebral media (ACM), es el modelo de monofilamento intraluminal ^8, en el que un filamento se introduce quirúrgicamente en la arteria carótida externa y se hace avanzar hasta que la punta ocluye la base de la MCA. A primary desafío de la oclusión filamento intraluminal es la alta tasa de mortalidad (70% cuando MCA está ocluida durante 3 horas, un punto de tiempo relevante para la investigación de accidentes cerebrovasculares) ^9. Otros problemas con el método incluyeron posible hemorragia subaracnoidea, la oclusión incompleta, y el volumen del infarto variable de ^10,11. Este modelo da como resultado un amplio grado de infarto tanto en la corteza y subcorticalmente ^12, y los modelos de un accidente cerebrovascular humana masiva.

Aunque tanto las micro y masiva modelos ictus son importantes, movimientos humanos son por lo general en algún punto intermedio. En grandes estudios clínicos, los rangos de tiempos de infarto de tamaño 28 a 80 cm ^3, que se traduce en 4,5 a 14% de la IPSI ishemic hemisferio ^9. En comparación, nuestros rata pMCAO el tamaño del infarto oscila entre aproximadamente 9-35 mm ^3, que constituye de 3 a 12% del hemisferio ipsilateral ishemic. Nuestro modelo pMCAO, por lo tanto, se asemeja mucho a los volúmenes de infarto con accidente cerebrovascular isquémico humanos por porcentaje de cerebrovolumen.

Además de modelar el daño estructural de accidente cerebrovascular, los resultados pMCAO en déficits funcionales y de comportamiento similares a la condición humana. Como mínimo, un modelo eficaz de los resultados de accidente cerebrovascular en trastornos del movimiento contralateral a daño por apoplejía ^13-15, pérdida o alteración de la función motora y sensorial ^16,17, pérdida o alteración de la actividad neuronal evocada ^16,18, reducciones en el flujo sanguíneo cerebral ^{19, 20,} e infarto ^21,22. Por consiguiente, nuestros modelos pMCAO una oclusión de la MCA grave resulta en una discapacidad física, pérdida de la función dentro de la corteza sensorial (y cortezas vecinos), la interrupción de la actividad neuronal, una severa reducción en el flujo sanguíneo MCA, y los atributos del infarto-sello de accidente cerebrovascular isquémico ^{23 -25,} por lo tanto, servir como un modelo efectivo de apoplejía humana.

Procedimiento, pMCAO implica una pequeña craneotomía en la que nos retiramos con cuidado el cráneo y la duramadreun x mm "ventana quirúrgica" 2 2 sobre el segmento inicial (M1) de la MCA, justo antes de la bifurcación primaria de la MCA en las ramas corticales anteriores y posteriores (Figuras 1A y 1B). Pasamos la mitad de la curva inversa de corte aguja e hilo de sutura (seda 6-0) a través de la capa pial de las meninges, por debajo de MCA y sobre la superficie cortical (véase la tabla de reactivos y equipos específicos para los suministros quirúrgicos necesarios para llevar a cabo pMCAO ). Luego atamos una doble ligadura, apriete los dos nudos alrededor de MCA, y seccionar el vaso entre los dos nudos. El doble ligadura y corte transversal a través de M1 se produce justo distal a la bifurcación lenticuloestriadas, de tal manera que sólo las ramas corticales de MCA son afectados-por lo tanto sólo de infarto cortical (sin daño subcortical) se produce ^26,27 (Figura 2). Aunque derrame cerebral humana a menudo implica infarto subcortical, modelar esto en roedores requiere aumento de la invasividad (ocluir los vasos cerebrales antes de la cortical Branching arterias requiere el acceso a través de la arteria carótida en el cuello y requiere oclusiones adicionales) y en la técnica de aumento de la variabilidad en el tamaño del infarto. El modelo descrito aquí no se puede realizar más proximalmente como el acceso a las ramas anteriores de la MCA no es posible a través de una simple craneotomía. Si bien puede ser posible inducir quirúrgicamente un infarto subcortical a través de pMCAO, oclusión implicaría un procedimiento muy invasivo y por lo tanto no es lo ideal.

Eficacia de la oclusión puede ser confirmado a través de láser Doppler, o láser speckle imágenes ^12,24,25 (Figura 3), o histológicamente post mortem (Figura 2). Cabe señalar que la investigación anterior ha demostrado que la estimulación sensorial puede desempeñar un papel importante en la evolución y el resultado de infarto; conferir protección contra el daño cuando se administra dentro de 2 h de pMCAO y causando un aumento en el daño por apoplejía cuando se administra a las 3 horas después de la pMCAO ^24,25,28. Hemos confirmado que a las 5 horas después de la pMCAO, la estimulación ya no tiene un efecto sobre el resultado (datos no publicados). Por lo tanto, la estimulación sensorial de los sujetos debe minimizarse durante 5 horas tras pMCAO obtener volúmenes de infarto con una variabilidad mínima. En consecuencia, nuestro grupo se ejecuta "controles no tratados" de este tipo, manteniendo las ratas anestesiadas durante 5 horas después de la pMCAO, en la oscuridad, con la estimulación sensorial mínimo, y expresamente sin estimulación bigote.

Cabe señalar además que la variación ocasional en la estructura de la MCA, incluyendo excesiva ramificación, múltiples segmentos primarios, o la ausencia de arterias comunicantes puede ocurrir a una frecuencia de 10 a 30% en adultos varones de ratas Sprague Dawley ^29,30. Si se observan anomalías en el MCA, se aconseja no utilizar este tema en particular como la adición de los animales con tales anomalías vasculares aumentará la variabilidad del infarto.

Además, hay varios aspectos prácticos de la oprocedimiento de ur que hacen que este método de oclusión ventajosa para la investigación apoplejía. En primer lugar, las suturas pueden ser colocados alrededor de la arteria, pero no apretados con el fin de recoger una evaluación de línea base, seguido de evaluación post-isquémica después de la ligadura y corte transversal. De esta manera, la preparación quirúrgica necesaria para la oclusión se controla eficazmente para, dentro de los sujetos. Debido a que los sujetos pueden permanecen estacionarios o dentro de un marco estereotáxico lo largo de la oclusión, es posible llevar a cabo la evaluación experimental de cada sujeto antes de, durante, y después de la oclusión sin mover el objeto o molestar a cualquier equipo experimental en uso ^25,28. Además, este procedimiento da como resultado una tasa de mortalidad muy baja, incluso dentro de los sujetos de roedores envejecidos 21-24 meses de edad (equivalente a un ser humano de edad avanzada) ^31, y por lo tanto pueden ser utilizados para evaluar los tratamientos con accidente cerebrovascular en ratas que más de cerca modelar los más comunes grupo de edad de los enfermos de ictus ^25,28. Vessel transection También sirve para varios propósitos prácticos. La ausencia de sangrado después de la transección confirma que el vaso se ocluye completamente en ambos sitios de ligadura. Además, la transección asegura una interrupción permanente de flujo sanguíneo. Por último, la transección asegura que cualquier flujo de sangre detectado en las porciones distales del vaso ocluido debe provenir de una fuente alternativa.

Por último, aunque se describe específicamente esta técnica de oclusión de la MCA en este manuscrito y de vídeo, la misma técnica transección doble ligadura se puede aplicar a cualquier vaso cerebral que se puede acceder a través de craneotomía. Nuestro laboratorio, por ejemplo, utiliza pMCAO en conjunción con varias oclusiones permanentes adicionales de MCA ramas distales con el fin de bloquear tanto primaria, y el flujo sanguíneo secundario ²⁴ de una manera similar a la de técnicas diseñadas para inducir selectivamente la isquemia dentro de la corteza somatosensorial primaria ^32.

En conclusión, tsu método para la oclusión permanente tal como se aplica a MCA modela estrechamente tres facetas principales de accidente cerebrovascular isquémico en humanos: la ubicación más común (MCA), tipo (isquemia), y el grado de daño (infarto) asociado con la literatura clínica humana de accidente cerebrovascular. Además, este método de oclusión se puede aplicar a uno o varios sitios de oclusión en todo el cerebro, y puede llevarse a cabo en sujetos de edad con una alta tasa de supervivencia. Dado el carácter dinámico y permanente, y relativamente no invasivo de esta oclusión, esta técnica representa una herramienta adicional a los investigadores preclínicos evalúan nuevos enfoques para la protección y tratamiento del ictus.

Protocol

1. Primeros pasos: Instrumentos quirúrgicos requeridos Vea la Figura 4 Taladro dental (Kavo Dental Equipment, modelo: UMXL-TM), taladro de 2 bits, y un taladro de 3 bits Dos agujas hipodérmicas de calibre 30 ~ Serrated pinzas, punta curvada opcional (puede ser útil, pero no esencial) Dos pinzas de punta fina cortador de alambre Hilo de sutura Micro tijeras 2. Creación …

Representative Results

Oclusión exitosa de un buque puede confirmarse mediante láser speckle imágenes (LSI), entre otras técnicas de imagen de flujo sanguíneo. El flujo de sangre en las principales ramas corticales de MCA debe caer a ~ 25% de la línea de base o menos siguiente oclusión en función del nivel de ruido en el sistema de grabación y la sensibilidad de la técnica. Ver la Figura 3 para una imagen representativa LSI de un segmento de una rama cortical del MCA antes y después de oclusión de…

Discussion

Este protocolo fue desarrollado con el fin de inducir isquemia dentro de la corteza de roedores, y hacerlo con un mínimo impacto periférico a los sujetos experimentales. El doble oclusión y transección método permite la confirmación visual de que el buque ha sido ocluida de forma permanente, y se pueden realizar sin invasión excesiva o daños en los tejidos, y con una alta tasa de supervivencia. Este protocolo de oclusión puede ser aplicada a cualquier recipiente de cortical que se puede acceder a través de cra…

Materials

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½” length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL