Permanent Cerebral Vessel Okklusjon<em> Via</em> Dobbel Ligatur og transection

Summary

Vi beskriver en svært reproduserbare metode for permanent okklusjon av en gnager store cerebrale blodkar. Denne teknikken kan oppnås med meget lite perifer skade, minimal blodtap, en høy grad av langvarig overlevelse, og konsistent infarktvolum i samsvar med den humane kliniske befolkning.

Abstract

Hjerneslag er en ledende årsak til død, uførhet, og sosioøkonomiske tap over hele verden. Majoriteten av alle slag skyldes et avbrudd i blodtilførselen (iskemi) ^1. Mellom cerebral arterie (MCA) leverer et stort flertall av blod til den laterale overflate av hjernebarken ^2, er den mest vanlige område av humant slag ^3, og iskemi sitt territorium kan resultere i omfattende dysfunksjon eller død ^1,4,5. Overlevende av hjerneinfarkt ofte lider tap eller avbrudd av motoriske evner, sensoriske underskudd, og infarkt. I et forsøk på å fange opp disse viktige kjennetegn ved hjerneslag, og dermed utvikle effektiv behandling, er en stor vekt lagt på dyremodeller av iskemi i MCA.

Her presenterer vi en metode for permanent tetter igjen en kortikale overflate blodåre. Vi vil presentere denne metoden ved hjelp av et eksempel på en relevant fartøy okklusjon som modellerer den vanligste typen, plassering og outcome av menneskelig slag, permanent midten cerebral arterie okklusjon (pMCAO). I denne modellen vi kirurgisk utsette MCA i voksen rotte og senere occlude via dobbel ligatur og transection av fartøyet. Dette pMCAO blokkerer kortikale proksimale gren av MCA, forårsaker iskemi i alle MCA kortikale territorium, en stor del av hjernebarken. Denne metoden for okklusjon kan også brukes til å okkludere mer distale partier av kortikale fartøy for å oppnå mer fokal iskemi rettet mot et mindre område av hjernebarken. De primære ulemper ved pMCAO er at den kirurgiske prosedyren er noe invasiv som en liten kraniotomi er nødvendig for å få tilgang til MCA, selv om dette resulterer i minimal vevsskade. De viktigste fordelene med denne modellen, derimot, er: åsted for okklusjon er godt definert, graden av blodstrøm reduksjon er konsistent, funksjonell og nevrologisk svekkelse skjer raskt, er infarktstørrelsen konsekvent, og den høye frekvensen av overlevelse gir lang Begrepet kronisk vurdering.

Introduction

For å indusere iskemiske tilstander som effektivt etterligner menneskelige iskemisk hjerneslag, er flere dyr takts modellene mye brukt, med varierende mengder infarkt som følge. I photothrombotic modellen, er hjernen bestråles gjennom den intakte skallen ved hjelp av laser-belysning etter intravenøs injeksjon av et fotofølsomt stoff (som rose-bengal), noe som resulterer i fotokjemisk koagulasjon, blokkering av de bestrålte fartøy, og iskemi innenfor omkringliggende vev ^{6, 7.} Photothrombosis kan resultere i svært små, isolerte regioner av infarktet og brukes vanligvis som et middel for modellering "mini-slag", eller "mikro-slag".

Jo mer utbredt teknikk for fremkalling iskemisk slag, spesielt i middel-cerebral arterie (MCA), er den intraluminale monofilament modell ⁸ hvori et filament er kirurgisk innført i den ytre halsarterie og avansert til spissen tetter bunnen av MCA. En primary utfordringen med intraluminal filament okklusjon er høy dødelighet (70% når MCA er blokkert i 3 timer, et relevant tidspunkt for hjerneslag forskning) ^9. Andre problemer med metoden inkludert mulig subaraknoidalblødning, ufullstendig okklusjon, og variabel infarktvolum ^10,11. Denne modellen resulterer i en omfattende grad av infarktet både i cortex og subcortically ^12, og modeller en massiv menneskelig slag.

Selv om både mikro-og massive takts modellene er viktige, menneskelige slag er vanligvis et sted i mellom. I store kliniske studier, hjerneslag infarkt varierer i størrelse 28-80 cm ^3, som kan oversettes til 4,5 til 14% av ipsi-ishemic halvkule ^9. Til sammenligning våre rotte pMCAO infarkt størrelse varierer fra ca 9-35 mm ^3, som utgjør 3-12% av ipsi-ishemic halvkule. Vår pMCAO modell, derfor ligner menneskelige hjerneinfarkt infarkt volumer av prosentandel av hjernenvolum.

I tillegg til å modellere den strukturelle skader for slag, pMCAO resulterer i funksjonelle og adferdsmessige mangler lik den humane tilstand. På minimum, en effektiv modell av hjerneslag resulterer i bevegelse underskudd kontralaterale å stryke skade ^13-15, tap eller avbrudd av motor og sensorisk funksjon ^16,17, tap eller avbrudd av fremkalt neuronal aktivitet ^16,18, reduksjoner i cerebral blodstrøm ^{19, 20,} og infarkt ^21,22. Følgelig våre pMCAO modeller en alvorlig okklusjon av MCA resulterer i fysisk funksjonshemming, tap av funksjon innenfor sensoriske cortex (og nabolandene cortices), forstyrrelse av neuronal aktivitet, en kraftig reduksjon i MCA blodstrøm, og infarkt-kjennetegn attributter av iskemisk hjerneslag ^{23 -25,} og derfor tjener som en effektiv modell for menneskelig slag.

Prosedyremessig innebærer pMCAO en liten craniotomy der vi forsiktig fjerne hodeskallen og dura fraen 2 x 2 mm "kirurgisk vindu" over det første (M1) segment av MCA, like før den primære bifurkasjon av MCA inn i de fremre og bakre kortikale grener (figurene 1A og 1B). Vi passerer en halv kurve reverse cutting sutur nål og tråd (6-0 silke) gjennom pial lag av hjernehinnene, under MCA og over kortikale overflate (se tabell over spesifikke reagenser og utstyr for de kirurgiske forsyninger nødvendig for å utføre pMCAO ). Vi deretter knytte en dobbel ligatur, stram de to knop rundt MCA, og skjære over fartøy mellom de to knop. Den dobbel ligatur og transection gjennom M1 oppstår like distalt for lenticulostriate forgrening, slik at bare de grener av kortikale MCA påvirkes således-bare kortikale infarktvolum (ingen skade subkritisk) oppstår ^26,27 (figur 2). Selv om menneskelige slag ofte innebærer subcortical infarktet, modellering dette hos gnagere krever økt invasivitet (occluding cerebral fartøy før cortical Branching krever tilgang arteries via carotisar i nakken og nødvendiggjør ytterligere occlusions) i teknikk og økt variasjon i infarktstørrelsen. Modellen er beskrevet her kan ikke utføres mer proksimalt som tilgang til tidligere grener av MCA er ikke mulig via en enkel craniotomy. Mens det kan være kirurgisk mulig å indusere en subcortical infarktet via pMCAO, ville okklusjon innebære en ekstremt inngrep og er derfor ikke ideelt.

Effektiviteten av okklusjon kan bekreftes via laser Doppler, eller laser spettet bildebehandling ^12,24,25 (figur 3), eller histologisk post-mortem (figur 2). Det bør bemerkes at tidligere forskning har vist at sansestimulering kan spille en viktig rolle i utviklingen og utfallet av infarktet, overdragelse beskyttelse mot skader når det gis innen 2 timer av pMCAO og forårsaker en økning i hjerneslag skade når administrert i 3 hr post pMCAO ^24,25,28. Vi har bekreftet at ved 5 timers post-pMCAO, stimulering ikke lenger har en effekt på resultatet (upubliserte data). Derfor bør sensorisk stimulering av fagene skal minimeres for 5 timer etter pMCAO å få infarkt volumer med minimal variasjon. Følgelig løper vår gruppe "ubehandlete kontroller" av denne type ved å holde rotter bedøvet i 5 t. post-pMCAO, i mørke, med minimal sensoriske stimuli, og uttrykkelig noen linje-stimulering.

Det bør videre bemerkes at sporadiske variasjon i MCA struktur, inkludert overdreven forgrening, flere primære segmenter, eller fraværet av kommuniserende arterier kan skje med en frekvens på 10 til 30% hos voksne hann Sprague Dawley-rotter ^29,30. Dersom avvik i MCA er observert, er det ikke tilrådelig å bruke det aktuelle faget som å legge dyr med slike karlidelser vil øke infarktet variabilitet.

I tillegg er det flere praktiske sider ved our prosedyre som gjør dette okklusjon metoden fordelaktig for hjerneslag etterforskning. Først kan sting plasseres rundt arterien men ikke strammet til for å samle en baseline vurdering, etterfulgt av post-iskemisk vurdering etter ligatur og transection. På denne måte blir Kirurgiske preparater nødvendig for okklusjon kontrolleres effektivt for, innen fag. Fordi fagene kan forbli stasjonær eller innen en stereotaksisk ramme gjennom okklusjon, er det mulig å gjennomføre eksperimentell vurdering av hvert emne, før, under og etter okklusjon uten å flytte emnet eller forstyrre noen eksperimentelle utstyret i bruk ^25,28. Videre denne prosedyren resulterer i en svært lav dødelighet, selv innenfor alderen gnager fagene 21-24 måneders alder (tilsvarer en eldre menneske) ^31, og kan derfor brukes til å evaluere hjerneslag behandlinger hos rotter som nærmere modellere den vanligste aldersgruppe av hjerneslag lider ^25,28. Fartøyet transection tjener også flere praktiske formål. Fravær av blødning etter transection bekrefter at fartøyet var helt tildekket på begge ligatur nettsteder. I tillegg sikrer transection en permanent forstyrrelse av blodstrøm. Endelig sikrer transection at enhver blodstrøm detektert i de distale deler av okkluderte fartøyet må komme fra en annen kilde.

Til slutt, selv om vi spesifikt beskrive denne okklusjon teknikk for MCA i dette manuskriptet og video, kan det samme dobbelt ligaturen transection teknikken brukes på alle cerebral fartøy som kan nås via craniotomy. Vårt laboratorium, for eksempel, benyttes pMCAO i forbindelse med flere andre permanente okklusjon av MCA distale grener for å blokkere både primær-og sikker-hetene blodstrømmen ²⁴ på en måte som ligner på teknikker utformet for selektivt å indusere iskemi innenfor det primære somatosensory cortex ^32..

Som konklusjon, tsin metode for permanent okklusjon anvendt på MCA nøye modeller tre primære aspekter av menneskelig hjerneinfarkt: den vanligste plassering (MCA), type (iskemi), og graden av skade (infarkt) forbundet med den menneskelige klinisk litteratur for slag. Videre kan denne metode for okklusjon anvendes til én eller flere stengbare steder i hjernen, og kan utføres i alderen individer med en høy sannsynlighet for overlevelse. Gitt den dynamiske, permanent, og relativt ikke-invasiv natur denne okklusjon, representerer denne teknikken et ekstra verktøy for prekliniske forskere vurdere nye tilnærminger for beskyttelse fra og behandling av hjerneslag.

Protocol

En. Komme i gang: Påkrevd kirurgiske instrumenter Se figur 4. Dental drill (Kavo tannlegeutstyr, Modell: UMXL-TM), to-bit drill, og tre-bit drill To ~ 30 gauge sprøyte nåler Taggete pinsett, buede spissen valgfritt (kan være nyttig, men ikke avgjørende) To fine tips pinsett trådkuttere Sutur tråden Micro saks 2. Opprette Kirurgisk Window Anestesi: Prose…

Representative Results

Vellykket okklusjon av et fartøy kan bekreftes ved hjelp av laser spettet imaging (LSI) blant annet blodstrøm imaging teknikker. Blodstrøm i de store kortikale grener av MCA bør slippe til ~ 25% av baseline eller mindre etter en okklusjon avhengig av nivået av støy i opptakssystemet og følsomhet av teknikken. Se figur 3 for en LSI representativt bilde av et segment av en kortikal gren av MCA før og etter MCA okklusjon. Når den beskrevne okklusjon teknikk påføres MCA på M1 se…

Discussion

Denne protokollen ble utviklet for å indusere iskemi innenfor gnager cortex, og å gjøre dette med minimal ytre påvirkning til eksperimentelle fag. Den doble okklusjon og transection metoden gjør det mulig for visuell bekreftelse på at fartøyet har blitt permanent tildekket, og kan utføres uten overdreven invasjon eller vevsskade, og med en høy overlevelse. Dette okklusjon protokollen kan brukes på alle cortical fartøy som kan nås via craniotomy for å indusere iskemi innenfor en bestemt cortical domene. Vide…

Materials

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½” length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL