El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
La inmunohistoquímica (IHC) proporciona una visualización altamente específico, fiable y atractivo proteína. rendimiento correcta y la interpretación de un etiquetado multicolor basado en la IHC es un reto, especialmente cuando se utiliza para la evaluación de las interrelaciones entre las proteínas diana en el tejido con un alto contenido de grasa, tales como el sistema nervioso central (SNC).
Nuestro protocolo representa un refinamiento de la técnica immunolabeling estándar especialmente ajustado para la detección de ambas proteínas estructurales y solubles en el CNS de rata y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) afectadas por la neuroinflamación. No obstante, con o sin modificaciones adicionales, nuestro protocolo probablemente podría ser utilizado para la detección de proteínas relacionadas con otros objetivos, incluso en otros órganos y especies que aquí se presenta.
Introduction
A pesar de la utilización de tecnologías avanzadas de alto rendimiento de los análisis realizados en el metiloma, transcriptoma o incluso de proteoma, inmunotinción sigue siendo el estándar de oro para la detección de proteínas directamente en la muestra de tejido, cultivo celular o un frotis celular. Al revelar el patrón de localización / distribución, inmunohistoquímica (IHC) puede evaluar proporciones relativas y las interrelaciones topográficas de las proteínas diana, e incluso indicar sus actividades biológicas. Por lo tanto, IHC se utiliza ampliamente para fines clínicos y de investigación, por ejemplo, para el diagnóstico, tratamiento, evaluaciones estudio de los mecanismos de la enfermedad, alteraciones funcionales y fenotípicas en modelos animales, etc.
Que comprende esencialmente la histología, patología, bioquímica e inmunología, IHC ha avanzado significativamente desde 1941, cuando se utilizaron anticuerpos marcados con fluorescencia por primera vez para identificar antígenos de neumococo en el tejido infectado 1. Visualization de productos y componentes por IHC celulares se basa en la unión de anticuerpos (Abs) a su antígeno específico (Ag). Además de utilizar anticuerpos fluoróforo etiquetado, reacciones inmunes también se pueden visualizar mediante el uso de enzimas como la peroxidasa de 2,3 o fosfatasa alcalina 4. Además, los anticuerpos de oro coloidal-etiquetado 5 se utilizan para detectar la interacción específica antígeno-anticuerpo tanto por microscopía óptica y electrónica, mientras marcadores radiactivos se visualizaron por autorradiografía.
La inmunorreacción Ag-Ab se puede detectar a través de métodos directos e indirectos. El método directo es esencialmente más rápido y más sencillo, ya que utiliza directamente etiquetada Abs primaria 6. Sin embargo, debido a la significativa falta de sensibilidad, los métodos indirectos se prefieren a los directos. Procedimientos de detección indirecta de dos pasos requieren no marcados Abs primaria, ya que el primero, y se marcaron Abs secundarios dirigidos contra el Abs primario, como la segunda capa 7.la amplificación de la señal se puede lograr mediante la participación adicional, terciaria Ab enzima acoplada (de tres pasos método indirecto) que se une al Ab secundario. métodos de detección indirectos utilizados están avidina-biotina y peroxidasa-antiperoxidasa (PAP). Alternativamente, fosfatasa alcalina fosfatasa antialkaline (APAAP) complejo se puede utilizar en lugar del método PAP. En particular, la fosfatasa alcalina (AP) métodos parecen ser aún más sensible que los métodos de inmunoperoxidasa 4. método del complejo avidina-biotina (ABC) utiliza biotina Ab secundario en combinación con la etiqueta complejo avidina-biotina (LAB), o el etiquetado de estreptavidina-biotina (LOSA). Sensibilidad de detección se puede aumentar más mediante la participación de avidina marcada con peroxidasa o fosfatasa alcalina 8. Otros métodos de detección utilizados son el etiquetado polimérico, tiramina y la amplificación círculo 9 inmuno-balanceo. En particular, los métodos de detección diferentes se pueden combinar para la detección múltiple Ag en el mismo tejidomuestra, el cual fue reportado por primera vez en 1978 4. inmunotinción doble simultánea que aquí se presenta se realizó en fijado en formol, ratas incluido en parafina cortes de tejido del SNC y LN utilizando peroxidasa unida y AP-conjugado con anticuerpos secundarios, respectivamente. Las señales se visualizaron utilizando 3,3'-diaminobencidina cromógeno (DAB) y el Fast Blue (FB) APAAP compleja, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los procedimientos estándar de IHC menudo requieren ajustes específicos para obtener un resultado óptimo, lo que comúnmente implica una amplia experiencia, sino también de "ensayo y error" enfoque. Desde la preparación hasta la visualización del tejido diana, casi cada paso en el protocolo puede ser sometida a modificaciones diseñadas de forma individual con el fin de mejorar el resultado final. protocolo de tinción doble que aquí se presenta un ejemplo de proteínas a base de IHC focalización parti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
Riferimenti
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