Immunohistokemisk analys i Rat centrala nervsystemet och perifera lymfkörtelvävnadssnitt
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
Immunohistokemi (IHC) ger mycket specifik, tillförlitlig och attraktiv protein visualisering. Korrekt prestanda och tolkning av en IHC-baserade multi märkning är utmanande, särskilt när de används för att bedöma samspelet mellan målproteiner i vävnaden med en hög fetthalt såsom det centrala nervsystemet (CNS).
Vår protokoll utgör en förfining av standard immunomärkning teknik särskilt justerat för detektering av både strukturella och lösliga proteiner i rått CNS och perifera lymfkörtlar (LN) som påverkas av neuroinflammationen. Icke desto mindre, med eller utan ytterligare modifieringar, våra protokoll kunde sannolikt användas för detektion av andra relaterade proteinmål, även i andra organ och arter än här presenteras.
Introduction
Trots användning av avancerad hög genomströmning analyser utförs på methylome, transkriptom eller proteom nivå, immunfärgning fortfarande den gyllene standarden för proteindetektion direkt i vävnadsprov, cellodling eller en cell cellprov. Genom att avslöja lokaliseringen / fördelningsmönstret kan immunohistokemi (IHC) bedöma relativa förhållanden och topografiska inbördes av målproteiner, och även ange sina biologiska aktiviteter. Därför är IHC allmänt används för kliniska och forskningsändamål, till exempel, för diagnos, behandling utvärderingar, studier av sjukdomsmekanismer, funktionella och fenotypiska förändringar i djurmodeller, etc.
I huvudsak bestående av histologi, patologi, biokemi och immunologi, har IHC betydande framsteg sedan 1941, när fluorescerande antikroppar användes för första gången för att identifiera pneumokocker antigener i den infekterade vävnaden 1. Visualization av cellulära produkter och komponenter från IHC är baserad på bindning av antikroppar (ABS) till deras specifika antigen (Ag). Förutom att använda fluorofor taggade antikroppar kan immunreaktioner även visualiseras genom användning av enzymer som peroxidas 2,3 eller alkalinfosfatas 4. Vidare är koUoidala guldmärkta antikroppar 5 används för att detektera specifik antigen-antikroppsinteraktion av både ljus- och elektronmikroskopi, medan radioaktiva märkningar visualiseras genom autoradiografi.
Ag-Ab immunoreaktion kan upptäckas via direkta och indirekta metoder. Den direkta metoden är väsentligen snabbare och enklare, eftersom den använder direkt märkt primär Abs 6. Men på grund av betydande brist på känslighet, är indirekta metoder föredrog att de direkta sådana. Två steg-anvisningar indirekt detektion kräver omärkt primär Abs, som den första, och märkt sekundära Abs riktade mot den primära Abs, som det andra skiktet 7.Signalförstärkning kan uppnås genom att involvera ytterligare, enzym-kopplad tertiär Ab (tre-stegs indirekt metod) som binder till den sekundära Ab. Vanligen använda metoder indirekta detektions är avidin-biotin och peroxidas-antiperoxidas (PAP). Alternativt kan alkaliskt fosfatas-antialkaline fosfatas (APAAP) komplex användas i stället för PAP-metoden. Noterbart är alkaliskt fosfatas (AP) metoder verkar vara ännu känsligare än immunoperoxidas metoder 4. Avidin-biotin komplex metod (ABC) använder biotinylerad sekundär Ab i kombination med antingen märkt avidin-biotin-komplex (LAB), eller streptavidin-biotin-komplex (SLAB). Detektionskänslighet kan ökas ytterligare genom att involvera avidin märkt med peroxidas eller alkaliskt fosfatas 8. Andra detektionsmetoder som används är polymera märkning, tyramin förstärkning och immunrullningscirkeln 9. Noterbart kan olika detektionsmetoder kombineras för flera Ag detektion i samma vävnadprov, som rapporterades för första gången år 1978 4. Samtidig dubbel immunfärgning presenteras här utfördes i formalinfixerade, paraffininbäddade råtta CNS och LN vävnadssnitt med hjälp av peroxidas-bundet och AP-konjugerade sekundära antikroppar, respektive. Signalerna visualiserades med användning av 3,3-diaminobencidine (DAB) kromogen och Fast Blue (FB) APAAP komplex, respektive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Standard IHC-procedurer kräver ofta särskilda anpassningar för att uppnå ett optimalt resultat, som ofta innebär omfattande erfarenhet men också "trial and error" -metoden. Från förberedelse vävnad tills målvisualisering, kan nästan varje steg i protokollet underkastas individuellt utformade ändringar för att förbättra slutresultatet. Dubbel färgningsprotokollet presenteras här exemplifierar IHC-baserade protein inriktning särskilt justerat för att bedöma samspelet mellan målproteiner av v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
Riferimenti
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. . Introduction to immunocytochemistry. , (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. . Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
- Van der Loos, C. . Immunoenzyme multiple staining methods. , (1999).
- Elias, J. . Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
