Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik
Summary
Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).
Abstract
Burada da dahil olmak üzere ilgi biyolojik örnekler için metabolik profilleri analiz etmek için bir iş akışı sunmak, hücreleri, serum veya doku. Örnek ilk olarak bir sıvı-sıvı faz çıkarımı ile, polar ve polar olmayan fraksiyonlar halinde ayrıldı ve kısmen aşağı analiz kolaylaştırmak için saflaştırılır. Ilk ekstraksiyon sulu (polar metabolitler) hem de organik (polar-olmayan metabolitleri) aşamaları metabolitlerin geniş bir anket için işlenir. Metabolitler kendi bölümü özelliklere bağlı olarak farklı sıvı kromatografisi yöntemleri ile ayrılırlar. Bu yöntemde, biz (UP) LC yöntemleri Mikrosirkülasyon ultra performanslı mevcut, ancak protokol daha yüksek akım ve düşük baskılara ölçeklenebilir. Kütle spektrometresi içine Giriş genel veya bileşik optimize edilmiş kaynak koşulları ya yoluyla olabilir. Iyon geniş bir aralığı saptanması en son C yüksek çözünürlük kullanılarak, geniş m / z aralığı üzerinde hem pozitif hem negatif modunda, tam tarama modunda gerçekleştiriliralet alibrated. Etiket-ücretsiz diferansiyel analizi biyoinformatik platformlarda gerçekleştirilir. Bu yaklaşımın Uygulamaları metabolik yolu tarama, biyolojik keşif ve ilaç geliştirme içerir.
Introduction
HRMS alanındaki son teknolojik gelişmeler nedeniyle, hedefsiz, hipotez üreten metabolomik yaklaşımları karmaşık numunelerin analizi için uygun bir yaklaşım haline gelmiştir. Milyonda rutin alt kısım kolaylaştırmak 100.000 çözünürlük (ppm) kütle doğruluk yeteneğine 1 kütle spektrometresi yaygın hale gelmiştir birden çok tedarikçiden temin. 2,3 Bu kitle doğruluğu daha fazla özgüllük ve analit kimlik, izotop örüntü tanıma, ve yaklaşımlı kimlik ön atama güven sağlar. 4 uygun bir çıkarma işlemi ve yüksek performanslı LC veya UPLC, kompleks karışımlar ile birleştiğinde tutma zamanlı veri elde edilen ek özgünlüğü ile analiz edilebilir. 5 UPLC büyük kromatografik verimlilik sahip ve sonucunda büyük veri setleri herhangi bir entegre edilebilir olası metabolome. 6 daha büyük bir kapsama yapmak daha yüksek hassasiyette, çözünürlük ve analiz süresi sağlarbirden fazla diferansiyel analiz yazılımı ve kullanışlı desen veya ilgi bireysel analit için mayınlı. 7,8,9,10,11 farzedilen hit ilk tepe algılama algoritmaları bir arada, doğru kitle tabanlı kimyasal formülü tahmini, parçalanma tahmini kullanılarak tespit edilebilir, ve kimyasal veritabanı arama. Bu yaklaşım zaman alıcı tam yapısal tanımlama için ya da daha duyarlı ve daha spesifik izotop seyreltme gelişimi için hedefler UPLC / Seçilen veya birden fazla reaksiyon izleme / ölçümü için mevcut altın standart yöntemlerdir MS çalışmaları. 12 önceliklendirilmesi
Biyolojik örneklerin değişen doğası idrar 13, hücre 14, 15, serum, veya doku 16 ekstraksiyon protokolleri optimizasyonu yol açmıştır. Bu protokol özellikleri çekimi hücreleri, serum ve doku için. Uygun olduğunda, yorum ve ek referanslar değişikliği yapılarak için dahil edilmiştirProsedürün lar kararlı izotoplar dahil ele, ya da özellikle kararsız metabolitleri dahil etmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hedefsiz metabolomik endojen veya ksenobiyotik biyotransformasyonları soruşturma, ya da ilgi örnek bir metabolik profil yakalamak için güçlü bir araç sunuyor. Çözünürlük ve hassasiyet, oluşturulan büyük veri setleri ile başa çıkmak için yeteneği örnek ayırmak ve analiz etmek için kullanılan teknoloji ve yararlı bilgiler (örneğin doğru kütle veritabanı arama) için veri kümesi benim için yeteneği ile teknik ölçeklerin çıktı. Son zamanlarda, bu yüksek çözünürlüklü kü…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz NIH hibe P30ES013508 ve 5T32GM008076 destek kabul. Ayrıca ELEK 2.0 ve Dr erişim için Thermo Scientific teşekkür ederim. Yararlı tartışmalar için Eugene Ciccimaro ve Thermo Scientific Mark Sanders.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
Riferimenti
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression – an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O’Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
