Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS)
Summary
Non ciblée métabolomique fournit une hypothèse générer instantané d'un profil métabolique. Ce protocole démontrera l'extraction et l'analyse des métabolites provenant de cellules, le sérum ou les tissus. Une gamme de métabolites sont interrogés par extraction en phase liquide-liquide, microflow UltraPerformance chromatographie liquide / haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS) couplé à un logiciel d'analyse différentielle.
Abstract
Nous présentons ici un flux de travail pour analyser les profils métaboliques des échantillons biologiques d'intérêt, y compris, les cellules, le sérum ou les tissus. L'échantillon est d'abord séparé en fractions polaires et non polaires par une extraction en phase liquide-liquide, et partiellement purifié pour faciliter l'analyse en aval. Les deux aqueuses (métabolites polaires) et organique phases (métabolites non polaires) de l'extraction initiale sont traitées pour étudier un large éventail de métabolites. Les métabolites sont séparées par différentes méthodes de chromatographie liquide en fonction de leurs propriétés de la partition. Dans cette méthode, nous présentons microflow ultra performant (UP) méthodes LC, mais le protocole est extensible à des débits plus élevés et des pressions plus basses. L'introduction dans le spectromètre de masse peut être soit par des conditions optimisées de source générales ou composé. La détection d'un large éventail d'ions est effectuée en mode balayage complet en mode à la fois positif et négatif sur une large gamme m / z en utilisant haute résolution sur un récemment calibrated instrument. Sans étiquette analyse différentielle est effectuée sur les plates-formes bioinformatique. Les applications de cette approche comprennent le dépistage métabolique de la voie, la découverte de biomarqueurs et le développement de médicaments.
Introduction
Grâce aux progrès technologiques récents dans le domaine de la gestion des ressources humaines, non ciblées, génératrice d'hypothèses métabolomique approches sont devenus une approche réalisable à l'analyse d'échantillons complexes. 1 spectromètres de masse capables de 100.000 résolution facilitant routine faible partie par million (ppm) Précision de masse sont devenus largement disponibles auprès de plusieurs fournisseurs. 2,3 Cette précision de masse permet une plus grande spécificité et la confiance dans une mission préliminaire de l'identité de l'analyte, reconnaissance de formes isotopiques, et l'identification des produits d'addition. 4 Lorsque couplé avec une méthode d'extraction appropriée et, mélanges complexes de haute performance LC ou UPLC peuvent être analysées avec une spécificité supplémentaire tirée des données de temps de rétention. 5 UPLC possède une plus grande efficacité chromatographique et permet une plus grande sensibilité, la résolution et l'analyse temps à faire une plus grande couverture du métabolome possible. 6 Les grands ensembles de données qui en résultent peuvent être intégrés dans n'importe quelde multiples logiciels d'analyse différentielle et exploitées pour les modèles d'utilité ou d'analytes individuels d'intérêt. 7,8,9,10,11 coups putatifs peuvent être initialement identifiés à l'aide d'une combinaison d'algorithmes de détection de pointe, précise basée sur la prévision de la formule chimique de masse, la prédiction de la fragmentation et recherche de base de données chimique. Cette approche permet la priorisation des objectifs de temps identification structurelle complète ou pour le développement de dilution des isotopes stables plus sensible et plus spécifique de surveillance UPLC / sélectionné ou multiple réaction / MS études qui sont les méthodes standards actuels de l'or pour la quantification. 12
La nature variable des échantillons biologiques a conduit à une optimisation des protocoles d'extraction d'urine 13, 14 cellules, le sérum 15 ou 16 tissu. Ce protocole caractéristiques extractions de cellules, le sérum et le tissu. Le cas échéant, des commentaires et des références supplémentaires ont été incluses pour moditions de la procédure pour l'inclusion des isotopes stables, ou l'inclusion des métabolites particulièrement instables.
Protocol
Representative Results
Discussion
Non ciblée métabolomique offre un outil puissant pour étudier biotransformations endogènes ou xénobiotiques, ou de capturer un profil métabolique d'un échantillon d'intérêt. La sortie de la balance de la technique avec la résolution et la sensibilité de la technologie utilisée pour séparer et analyser l'échantillon, la capacité de faire face aux grands ensembles de données générées, et la possibilité d'exploiter l'ensemble des données des informations utiles (par exemple,</em…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons l'appui de subventions des NIH P30ES013508 et 5T32GM008076. Nous remercions également Thermo Scientific pour l'accès au tamis de 2,0 et Drs. Eugene Ciccimaro et Mark Sanders de Thermo Scientific pour des discussions utiles.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
Riferimenti
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression – an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O’Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
