אנו מתארים את האוסף של מופרה<em> Xenopus tropicalis</em> ביצים וייצור של תמצית ביצה השנייה, נעצר מיוזה. תמצית ביצה זה יכול לשמש כדי לטהר microtubules וRNAs microtubule הקשורים.
אורגניזמים רבים למקם mRNAs ליעדי subcellular ספציפיים לביטוי גני שליטת מרחב ובזמן. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי הרוב המכריע של transcriptome הוא מקומי למיקום אקראי בתאים ועובר. גישה אחת לזהות mRNAs מקומית היא לטהר יוכימית מבנה תאי של עניין וכדי לזהות את כל התמלילים הקשורים. תוך שימוש בטכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה שפותחו לאחרונה עכשיו זה פשוט לזהות את כל RNAs הקשורים למבנה subcellular. כדי להקל על זיהוי תמליל יש צורך לעבוד עם האורגניזם עם הגנום רצף במלואו. מערכת אחת אטרקטיבית לטיהור הביוכימי של מבני subcellular הן תמציות המופקות מביציות הצפרדע Xenopus laevis. עם זאת, X. laevis אין כרגע הגנום רצף באופן מלא, מה שפוגע בזיהוי תמליל. במאמר זה אנו מתארים שיטהכדי להפיק תמציות מביצת צפרדע קשורה, X. tropicalis, שיש לו רצף הגנום מלא. אנו מספקים פרטים לפילמור microtubule, טיהור ובידוד תמליל. בעוד מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי ספציפית של תמלילי microtubule הקשורים, אנו מאמינים שזה ייושם בקלות למבני subcellular אחרים ויספק שיטה רב עוצמה לזיהוי של RNAs מקומי.
שליטה במרחב ובזמן של ביטוי גנים הוא חשובה לכל התאים, וחשוב במיוחד לשליטה על עוברית מוקדמות מטופף 1. שליטה במרחב של ביטוי גנים מושגת באמצעות הלוקליזציה הפעילה של mRNAs ליעדים ספציפיים בתוך תאים או בעוברים. בסוגי תאים רבים גדולים מאוד, (למשל ביציות, עובר, ועל נוירונים) משמשת לוקליזציה mRNA כדי להגביל ביטוי חלבון לאתר פעולה של החלבון המקודד. מאז ה-mRNA מקומית יכולה לזרז סיבובים רבים של ייצור חלבון הוא יעיל יותר בתרגום ה-mRNA מלמקם מולקולות חלבון בודדות. mRNAs מקומית בדרך כלל מודחקת translationally עד שהם מגיעים ליעדם, המשמש להגבלת הלוקליזציה של החלבון המקודד 2 נוספת. בנוסף למקרים המתועדים היטב הרבים של RNA לוקליזציה לשלוט דפוסים עובריים, מספר מחקרים תעדו mRNAs שהן נקודותלאתר פעולה של החלבון המקודד. דוגמאות בולטות כוללות לוקליזציה של β-אקטין 3 וArp2 / 3 4 mRNAs לקצה המוביל של fibroblasts הנעים ובלוקליזציה של mRNAs לרגולטורי mitotic רבים לmeiotic וmitotic צירים 5-7.
רבים מדוגמאות קלאסי של mRNAs המקומיות זוהו באמצעות מסכי גנטיים למוטציות השפעה אימהיות ולאחר מכן נקבעו לקידוד RNAs מקומי. עם זאת, מחקרי הגנום האחרונים החלו לספק תובנה רחבה יותר בהיקף של RNAs מקומי. אחרונים במסך הכלאה באתר בעוברים תסיסנית הוכיח כי ~ 70% מכל mRNAs יש לוקליזציה ספציפית, כולל יעדים רבים רומן 8. טיהור pseudopodia מfibroblasts העכבר זיהתה קבוצה מגוונת של מקומי mRNAs 9. עובד מהקבוצה שלנו באמצעות טיהור ביוכימי של microtubules מmeiotic קסנומוגלה ביצה מחלצת מאות מזוהים של mRNAs כי copurify עם ציר 5,7. העבודה שלנו הראתה כי הרוב המכריע של mRNAs microtubule ההמקומית לקודד חלבונים המתפקדים בשליטה של מיטוזה, תומך ברעיון שmRNAs מותאמת לשפה מקומית לאתר פעולה של החלבון המקודד. יתר על כן, היכולת לזהות העשרת mRNA בשבריר subcellular על ידי טיהור ביוכימי מדגישה את כוחה של גישה זו לזיהוי mRNAs מקומית.
RNAs מקומי ביותר להשתמש בתחבורה פעילה בשלד התא, או אקטין או microtubules, כדי להשיג את ההובלה ליעד הסופי שלהם 10. כדי להשיג הבנה טובה יותר של ההיקף והסוגים של RNAs המקומיים ליעדים ספציפיים באמצעות גישה ביוכימית זה יש צורך יש במערכת במבחנה שיכול לסכם תהליכי cytoskeletal. אחת מהמערכות המובילות ללימוד הביולוגיה cytoskeletal הוא תמציות ביצים יוצרמהביצים מופרות מצפרדע Xenopus laevis. X. תמציות ביצת laevis שמשו במשך עשרות שנים כדי ללמוד מגוון רחב של תהליכי cytoskeletal ותרמו הרבה להבנתנו את המנגנונים והמולקולות השולטים הרכבה cytoskeletal ו11 דינמיקה שלנו. יתר על כן, X. תמציות ביצת laevis ניתנות לpurifications בקנה מידה גדולה של microtubules וחלבונים הקשורים 12,13 ויש שיטות מעוצבות היטב לייצור סוגים שונים של תמציות ביצים 14-16. עם זאת, למחקרים גנומיים יש כמה חסרונות לשימוש בX. laevis כמערכת מודל.
במשך עשרות שנים צפרדעי laevis Xenopus היו מערכת רב עוצמה לחקר ביולוגיה התפתחותית ותא, בשל גודל הביצית הגדול ופיתוח חיצוני 17 חזק. יתר על כן, הפיתוח של מערכות תמצית ביצים שיכולים לסכם רבים processe הסלולריים במבחנה הפך צפרדע זה מודל ניסיוני רב עוצמה. עם זאת, Xenopus laevis כבר הקשו על ידי חוסר רצף הגנום מלא, שהואט על ידי טבע allotetraploid של ניגוד genome.In, מין הקשורות באופן הדוק, Xenopus tropicalis, יש גנום דיפלואידי שהיה רצף בשינה 2010 18. בעוד X. tropicalis לא כצייתן באופן ניסיוני כX. laevis 17 הזמינות של הגנום רצף הופך אותו למערכת אטרקטיבית מודל לבצע ניתוחים רחבים הגנום.
בדו"ח זה אנו מתארים שיטה לעשות תמציות גורם-II-נעצרו, cytostatic מיוזה (CSF) מX. tropicalis 19. לאחר מכן, אנו מתארים שיטה פשוטה לטהר microtubules וRNAs הנלווים מתמצית זו. את RNAs לאחר מכן ניתן להמיר את ספריות המתאימים לשימוש בטכנולוגיות רצף רצף פותחו לאחרונה תפוקה גבוהה. ברגע שהספריותהם רצף שהם יכולים להיות מיושרים לגנום של הצפרדע לזהות mRNAs ספציפית שמועשרות במדגם microtubule בהשוואה לתמצית מוחלטת. זה מספק שיטה רב עוצמה לאיתור לוקליזציה mRNA microtubule ממוקדת בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף להיותו מסוגל לזהות mRNAs מקומית, השימוש ברצף תפוקה גבוהה ורצף הגנום מציע את האפשרות של גילוי תמלילי רומן שאינם נמצאים כרגע בהווה בביאורי מסדי נתונים ציבוריים.
בדוח זה שתארנו שיטה פשוטה לייצור תמציות ביצת CSF-נעצר מX. tropicalis 19 ולהשתמש בתמצית זו כדי ללמוד RNAs microtubule הקשורים 7. ההליך הבסיסי לייצור תמציות ביצת CSF-נעצרו מX. tropicalis זהה המשמש לX. laevis עם כמה הבדלים מרכזיים. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר לעבודה עם X. צפרדעי tropicalis היא השגת ביצים באיכות גבוהות מספיק כדי להפוך את תמצית עם נוקלאציה microtubule או פעילות דומה להרכבת ציר X. laevis ביצת תמציות. כדי להשיג תנאי הטלה אופטימליים תוך מניעת זליגה ממעצר המיוזה השנייה במחזור תא, המרווח בין זריקות הורמונים לX. tropicalis הוא קצר יותר מזה המשמש לX. laevis, והעיתוי מהזרקת hCG השלישי לתחילת הנחת ביצה הוא גם הרבה יותר קצר. עם X. laevis עיתוי מהזרקת hCG כדי לאהוא תחילת הנחת ביצה היא כזה שהוא נוח ויעיל לביצים שהונחו בין לילה לחיץ. עם זאת, בשל הזמן הקצר יותר בין ההזרקה וביצת hCG הנחת עם X. tropicalis זה הוא לעתים קרובות הכרחי כדי לבטא באופן ידני את הביצים מצפרדעים. עוד הבדל משמעותי בין מה שהופך את תמצית ביצה משתי הצפרדעים השונות הוא צעד dejellying. עם X. laevis את הביצים כל כך גדול שזה קל לקבוע מתי מעיל הריבה נמס על ידי התבוננות כיצד מקרוב את הביצים הם מרווחים בכוס. כתגובת dejellying מתחילה, את הביצים להתחיל לארוז יותר בצפיפות. עם זאת, X. ביצי tropicalis הן הרבה יותר קטנים וזה יכול להיות די קשה לקבוע מתי מעיל הריבה נמס בביצת אריזת צפיפות לבד. מצאנו כי השיטה אמינה ביותר לקבוע מתי מעיל הריבה נמס היא לפקח על נטייתו של בעל החיים (שחור) וצמחיים (לבן) הקטבים. כאשר כל קטבי אורי צמחייםאף אוזן גרון לכיוון החלק התחתון של כוס ריבת מעיל הוסר מספיק כדי להמשיך עם התמצית. לבסוף, ואילו X. ניתן לאחסן תמצית ביצת laevis בטמפרטורות קרירות (4-12 מעלות צלזיוס) שראינו שזה הוא קריטי כדי לשמור על X. תמצית ביצת tropicalis בטמפרטורת חדר (20-25 ° C) במהלך הכנה ומניפולציות ניסיוני כדי לשמר את הפעילות ביוכימית. בגלל ההבדלים בנוחות שימוש שאנו מעדיפים להשתמש X. צפרדעי laevis לייצור של תמצית ביצים. עם זאת, בניסויים שדורשים או בהנחייתם של האורגניזם עם רצף הגנום, X. tropicalis הוא מערכת אלטרנטיבית מצוינת.
השיטה שתארנו בדוח זה משתמש בטקסול כסוכן microtubule-מייצב כדי לגרום פילמור microtubule. אנחנו בחרנו בשיטה זו משום שטקסול הוא סוכן microtubule-מייצב חזק המאפשר בידוד בקנה מידה גדולה של מטוהרים microtubules. ה השיטהשבתארנו סביר יכול להיות שיפור באמצעות השוואת בין החלבונים RNAs קשורים microtubules בשיטות פילמור microtubule חלופיות. חלופות יכולים לכלול פילמור באמצעות GTP-Induced פילמור (טכניקה קלאסי), 22 או שימוש ברן-GTP כpolymerizer microtubule לחקות את microtubules הנגרמת על ידי הרכבה ציר הכרומטין מונחה 23. לבסוף, שימוש מטוהר גרעיני זרע כדי לגרום פילמור microtubule יהיה לחקות הקרוב ביותר לסוגי microtubules הnucleated במהלך מיטוזה (centrosome, הכרומטין, ותיווך kinetochore). חסרונות למקורות חלופיים אלה של נוקלאציה microtubule הם כי סוכני nucleating הם לא ברצון כטקסול והם לא nucleate או לייצב microtubules בצורה יעילה ככל טקסול. לכן, כל אחת מהשיטות הללו, יהיה קשה יותר לשימוש עבור purifications בקנה מידה גדולה. היתרון של השוואה בין סוגים שונים מרובים של nucleators microtubuleהוא שזה יכול להיות אפשרי לזהות חלבונים ו / או RNAs שהם ספציפיים לכל מסלול של נוקלאציה microtubule.
השיטה שתארנו כאן מנצלת תמציות cytoplasmic של דו חיים. עם זאת, גישה זו ניתן תהיה להרחיב את השימוש במערכת לחלץ מאורגניזמים אחרים. תמציות mitotic כבר תאר ממסונכרן תאי תרבית רקמה אנושיים 24 שנאמנו לסכם היבטים רבים של ההרכבה microtubule. אנחנו השתמשנו בהצלחה תמציות אלה כדי לזהות RNAs microtubule הקשורים מהלה תאים 5. תוכניות טיהור microtubule דומות תוארו לאורגניזמים רבים ושונים 25,26, אם כי כאמור לא נבדק בRNAs קשורים microtubule. הגישה שתוארה כאן יכולה לשמש עם כל אורגניזם שיכול לייצר תמצית מרוכזת cytoplasmic מסוגלת nucleating microtubules.
לבסוף, למרות שהגישה שאנו דהסופר דן כאן טיהור microtubules וחלבוני RNAs נלווים, גישה זו יכולה להיות מוכללת למבני subcellular אחרים. בעוד mRNAs המקומיות ביותר לא זוהתה באמצעות שיטות ביוכימיות את ההתקדמות בטכנולוגיות ה-DNA ורצף RNA להפוך גישה זו שיטה אטרקטיבית לזהות RNAs מקומי. בגישה זו כל מבנה subcellular או תת עובר של עניין יכול להיות מבודד או מטוהרים. ואז את החלבונים RNAs הנלווים יכולים להיות מזוהים בקנה מידה רחב הגנום. לאחר מכן ניתן להשוות RNAs לתוכן RNA של התא המוחלט או העובר לזהות RNAs מקומי מועשר. גישה זו יכולה להיות בשימוש עם ביצים שלמות (של בעלי חיים וצמחי הפרדה, בדומה לגישה שזיהתה את RNAs המקומיים הראשון בXenopus 27), RNAs קשורים אקטין, RNAs ER-RNAs נלווים, הקשורים למיטוכונדריה, או לכל מבנה שיכול subcellular להיות מטוהר עם RNAs הנלווים ללא פגע. בהתבסס עלהעבודה שלנו על microtubule הקשורים RNA אנו צופים שזו תהיה שיטה מצוינת לגלות חלבונים חדשים שפועלים במיקום נתון. יתר על כן, זיהוי של המיקום וההיקף של כל RNAs המקומיים יספק תובנה כיצד תאים ועוברים להשתמש בלוקליזציה mRNA לשלוט על ביטוי גנים.
The authors have nothing to disclose.
REAGENTS | |||
Xenopus tropicalis | NASCO | LM00823MX | |
human Chorionic Gonadotropin | Sigma-Aldrich | CG10 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Leupeptin | Sigma-Aldrich | L9783 | |
Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
Gelatin, porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Taxol | Sigma-Aldrich | T7191 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
L-Cysteine, free base | USB Corporation | 14030 | |
Cichlid Lake Salt | Seachem | 47894 | |
Marine salt | Seachem | SC7111 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
EQUIPMENT | |||
1 ml syringes | BD Biosciences | 309659 | |
18 gauge needles | BD Biosciences | 305195 | |
30 gauge needles | BD Biosciences | 305106 | |
Rubbermaid Plastic bucket | Amazon | 6306 | |
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes | Beckman | 326819 | |
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes | Fisher Scientific | 45500-15 | |
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes | Kimble-Chase | 45550-15 | |
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
14 ml polypropylene round-bottom tube | BD Biosciences | 352059 | |
Sorvall HB-6 rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC-6 centrifuge | Thermo Scientific | 46910 |